左月明，陈林林，张忠立（江西中医药大学，南昌 330004）

百合科延龄草属（

Trillium

L.）植物，我国有3 种，分别为延龄草（

Trillium tschonoskii

Maxim.）、西藏延龄草（

Trillium govanianum

wall.ex Royle）和吉林延龄草（

Trillium kamtschaticum

Pall.ex Puersh）。延龄草药材又名头顶一颗珠、芋儿七和狮儿七等，药用部位为根及根茎，其味甘、性平、有小毒，有延年益寿的功效，主治头晕、跌打损伤、高血压病和脑震荡后遗症等疾病，为土家族常用药材。目前已从延龄草属植物中分离得到100 多个化合物，分别为甾体皂苷类、倍半萜苷类、黄酮苷类、苯丙素苷类等成分。重楼皂苷Ⅵ、重楼皂苷Ⅶ等甾体皂苷成分为延龄草药材主要的药效物质，也是中药重楼的主要药效成分，具有抗炎、活血、抗心脑缺血和抗阿尔茨海默病等药理作用。通过市场调查发现，目前国内几大药材市场流通的延龄草药材大多来自湖北、吉林、陕西等地产的延龄草和吉林延龄草，两者植物形态可明显区分，但药用部位不易辨认。目前国内文献报道大多针对延龄草的质量控制研究，而对市场上供应量最大的吉林延龄草缺少完善的质量控制标准。因此，本文拟采用HPLC 法建立21 批延龄草根茎样品的指纹图谱和主成分含量测定方法，并应用多种化学计量学分析方法对不同产地延龄草根茎样品进行统计分析，为其质量控制提供依据。

1 材料

1.1 仪器

Waters2695 型高效液相色谱仪（美国沃特世公司）；CP225D 十万分之一分析天平（北京赛多利斯有限公司）；KQ-700DE 超声清洗机（昆山超声仪器有限公司）；HH-6 数显恒温水浴锅（常州市凯航仪器有限公司）。

1.2 试药

偏诺皂苷元-3-

O

-

α-L

-吡喃鼠李糖基-（1 →2）-

O

-

β

-

D

-吡喃葡萄糖苷，即重楼皂苷Ⅵ（简称Y2T）；偏诺皂苷元-3-

O

-

α

-

L

-吡喃鼠李糖基-（1 →4）-[

O

-

α-L

-吡喃鼠李糖基-（1 →2）]-

O

-

β

-

D

-吡喃葡萄糖苷（简称Y3T）；偏诺皂苷元-3-

O-α

-

L

-吡喃鼠李糖基-（1 →4）-

O

-

α-L

-吡喃鼠李糖基-（1 →4）-[

O

-

α

-

L

-吡喃鼠李糖基-（1 →2）]-

O

-

β

-

D

-吡喃葡萄糖苷，即重楼皂苷Ⅶ（简称Y4T），均为白色粉末（纯度均大于98.0%，实验室自制）。乙腈、甲醇均为色谱纯（德国默克公司）；纯净水（杭州娃哈哈有限公司）。延龄草根茎药材样品S1 ～S10 为延龄草、S11 ～S21 为吉林延龄草，经江西中医药大学药学院中药鉴定教研室左月明教授鉴定为百合科延龄草属植物延龄草

Trillium tschonoskii

Maxim.和吉林延龄草

Trillium kamtschaticum

Pall.ex Puersh的干燥根茎。药材信息见表1。

表1 延龄草根茎药材样品信息
Tab 1 Information of rhizomes sample

序号产地序号产地S1陕西省宝鸡市眉县（栽培）S12吉林省白山市靖宇县（栽培）S2陕西省安康市旬阳县（栽培）S13吉林省桦甸市红石镇（栽培）S3陕西省安康市镇坪县（栽培）S14吉林省蛟河市（栽培）S4湖北省恩施土家族苗族自治州1（栽培）S15吉林省延边朝鲜族自治州汪清县（栽培）S5湖北省宜昌市木鱼镇4年生（栽培）S16吉林省长白山保护区池北区5年生（野生）S6甘肃省大别山地区（野生）S17吉林省长白山保护区池北区4年生（野生）S7湖北省宜昌市木鱼镇5年生（栽培）S18吉林省延边朝鲜族自治州汪清县（栽培）S8湖北省神农架地区5年生（野生）S19吉林省延边朝鲜族自治州安图县4年生（栽培）S9湖北省神农架地区4年生（野生）S20吉林省延边朝鲜族自治州安图县3年生（栽培）S10湖北省恩施土家族苗族自治州2（栽培）S21吉林省延边朝鲜族自治州安图县5年生（栽培）S11吉林省白山市江源区湾沟镇（栽培）

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Diamonsil（2）C色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流速1.0 mL·min，检测波长203 nm；柱温30 ℃；流动相乙腈（A）-水（B），梯度洗脱（0 ～22 min，5% ～45%A；22 ～37 min，45%A；37 ～42 min，45% ～85%A；42 ～50 min，85%A）。

2.2 延龄草HPLC 指纹图谱研究

2.2.1 供试品溶液的制备 称取延龄草根茎药材粉末（过3 号筛）约1.0 g，置于250 mL 圆底烧瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，称重，回流提取2 h，放冷后称重，用70%甲醇补足失重，过滤，蒸干，甲醇复溶，定容于10 mL 量瓶中，超声混匀，过0.22 μm 微孔滤膜，取续滤液，即得。

2.2.2 对照品溶液的制备 分别精密称定Y2T、Y3T和Y4T 对照品25.00 mg，置于5 mL 量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，稀释成系列浓度，即得。

2.2.3 精密度试验 称取延龄草根茎药材粉末（编号S20）约1.0 g，按照“2.2.1”项下方法制备成供试品溶液，连续进样6 次。以9 号峰Y3T 为参照峰（该峰的相对保留时间变化稳定、分离度良好，且其为延龄草药材的特征性成分），记录各共有峰的相对保留时间与相对峰面积。结果显示，各共有峰相对保留时间

RSD

均小于0.089%，相对峰面积

RSD

均小于3.0%，表明仪器精密度良好。2.2.4 稳定性试验 称取延龄草根茎药材粉末（编号S20）约1.0 g，按照“2.2.1”项下方法制备成供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24 h 进样。以9 号峰为参照峰，记录各共有峰的相对保留时间与相对峰面积。结果显示，各共有峰相对保留时间

RSD

均小于0.24%，相对峰面积

RSD

均小于3.0%，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。2.2.5 重复性试验 称取延龄草根茎药材粉末（编号S20）约1.0 g，按照“2.2.1”项下方法平行制备成6 份供试品溶液，进样测定。以9 号峰为参照峰，记录各共有峰的相对保留时间与相对峰面积。结果显示，各共有峰相对保留时间

RSD

均小于0.15%，相对峰面积

RSD

均小于3.0%，表明方法重复性良好。2.2.6 指纹图谱的建立及相似度评价 将21 批供试品溶液，进样测定，记录色谱图。将所得21批延龄草根茎药材色谱图数据依次导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012 版）》软件，以样品S20 图谱为参照指纹图谱，采用平均数法，时间窗宽度为0.5 生成对照指纹图谱，采用多点校正后进行全谱峰自动匹配，见图1。各共有峰相对保留时间的

RSD

均小于1.0%。对21 批延龄草根茎药材样品HPLC 色谱图与对照指纹图谱进行相似度评价，结果表明S1 ～S21 号样品与对照指纹图谱的相似度介于0.824 ～0.972（见表2），除样品S12 的相似度（0.824）和S21 的相似度（0.890）低于0.900 之外，其余样品化学成分组成基本相同，差异较小，且栽培品种与野生品种的相似度也达到0.900 以上，表明本文中不同产地延龄草药材的质量较稳定，野生与栽培品种指纹图谱无明显差异。

表2 21 批延龄草根茎药材样品HPLC 指纹图谱相对相似度评价
Tab 2 Relative similarity evaluation of HPLC fingerprints of 21 batches of rhizomes sample

序号相似度序号相似度序号相似度S10.950 S80.972 S150.952 S20.952 S90.953 S160.953 S30.968 S100.971 S170.951 S40.931 S11 932 S12 945 S130.943 S180.931 S50.0.824 S190.955 S60.0.924 S200.915 S70.924 S140.959 S210.890

图1 21 批延龄草根茎药材样品HPLC 指纹图谱Fig 1 HPLC fingerprints of 21 batches of Trillium kamtschaticum rhizome sample

2.2.7 指纹图谱共有峰的指认与归属 取21 批延龄草根茎药材样品色谱图，共确定10 个共有峰，通过保留时间和紫外图谱对照分析，指认了3个共有峰，8 号峰为重楼皂苷Ⅶ（Y4T）、9 号峰为偏诺皂苷元-3-

O

-

α

-

L

-吡喃鼠李糖基-（1 →4）-[

O

-

α-L

-吡喃鼠李糖基-（1 →2）]-

O

-

β

-

D

-吡喃葡萄糖苷（Y3T）、10 号峰为重楼皂苷Ⅵ（Y2T），混合对照品和延龄草根茎药材样品的HPLC 色谱图见图2。

图2 混合对照品（A）和延龄草根茎药材样品（B）的HPLC 图Fig 2 HPLC chromatograms of mixed reference substances（A）and Trillium kamtschaticum rhizomes sample（B）

2.3 延龄草根茎药材中3 种主要成分的含量测定

课题组前期在对延龄草根茎药材成分的研究中，发现药材中甾体皂苷Y4T、Y3T 和Y2T 含量较高，其中Y3T 是延龄草中的专属性成分，且在203 nm 处有紫外吸收，可以直接用紫外检测器进行含量测定，方法简便，并对分离得到的3 种对照品进行结构鉴定和解析，确定延龄草HPLC 指纹图谱中8、9、10 号色谱峰分别为Y4T、Y3T 和Y2T，均为含量较高的色谱峰，能较好地反映药材的质量。因此，本研究选择这3 个指标成分进行含量测定。

2.3.1 专属性试验 从图2 可知，延龄草样品中甾体皂苷Y4T（8 号峰）、Y3T（9 号峰）、Y2T（10号峰）各峰的分离度良好，其保留时间分别为27.02、27.90 和30.23 min。

2.3.2 线性关系考察 分别精密量取对照品溶液适量，稀释得最终质量浓度分别为0.025、0.050、0.100、0.200、0.400、0.800、1.600、3.200、5.000 mg·mL的Y2T、Y3T、Y4T 系列对照品溶液。经0.22 μm 微孔滤膜过滤后，分别精密吸取各系列对照品溶液10 μL，进样测定，记录峰面积。以药物质量浓度（

X

，mg·mL）为横坐标，峰面积值（

Y

）为纵坐标，进行线性回归分析，得回归方程，

Y

＝3.675×10

X

＋2.644×10，

r

＝0.9999；

Y

＝3.070×10

X

＋5.073×10，

r

＝0.9999；

Y

＝2.564×10

X

＋3.368×10，

r

＝0.9999（

n

＝9）。结果表明Y2T、Y3T、Y4T 均在质量浓度0.025 ～5.000 mg·mL内的质量浓度（

X

）与峰面积值（

Y

）呈良好的线性关系。2.3.3 精密度试验 精密称定延龄草根茎药材粉末（编号S20）约1.0 g，按“2.2.1”项下方法制备成供试品溶液，连续进样6 次，记录色谱峰面积。计算Y2T、Y3T、Y4T 峰面积的

RSD

分别为1.6%、1.4%、1.7%，表明仪器精密度良好。2.3.4 稳定性试验 精密称定延龄草根茎药材粉末（编号S20）约1.0 g，按“2.2.1”项下方法制备成供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24 h 进样测定，记录色谱峰面积。计算Y2T、Y3T、Y4T 各成分峰面积的

RSD

分别为1.8%、1.7%、1.8%，表明24 h 内供试品溶液的稳定性良好。2.3.5 重复性试验 精密称定延龄草根茎药材粉末（编号S20）约1.0 g，按“2.2.1”项下方法制备成供试品溶液，连续进样6 次，记录色谱峰面积，代入标准曲线进行含量计算，计算Y2T、Y3T、Y4T 含量的

RSD

分别为1.0%、1.6%、1.2%，表明该方法重复性良好。2.3.6 加样回收试验 精密称定延龄草根茎药材粉末（编号S20）约1.0 g，按照对照品量-样品中含量约1∶1 的比例，加入Y2T、Y3T、Y4T 对照品，平行制备6 份样品溶液，进样测定，记录峰面积，代入标准曲线进行含量计算，并计算回收率。结果表明Y2T、Y3T、Y4T 的平均加样回收率分别为103.0%、98.8%、99.2%，

RSD

分别为1.3%、1.1%、1.9%，表明该方法准确度良好。

2.3.7 含量测定 取21 批延龄草根茎药材指纹图谱测定用样品溶液，进样测定，采用外标一点法计算样品中3 个成分的含量，结果见表3。由表3 可知，不同产区的延龄草根茎中延龄草皂苷含量不同，Y2T 含量范围在10.71 ～27.65 mg·g，Y3T 在9.27 ～24.80 mg·g，Y4T 在2.84 ～8.95 mg·g，总皂苷含量在23.96 ～61.40 mg·g，其中S12 号样品在3 个指标成分含量和总皂苷含量均为最高，而S10 号样品在Y3T、Y4T 和总皂苷含量均为最低。从3 个指标成分在延龄草根茎药材中的含量分布来看，21 批样品中Y2T 含量略高于Y3T 含量，而Y4T 含量相对较低，且3个指标成分含量的相对比例存在一定的差异。所以，选择延龄草中3 个指标成分总含量能较好地控制延龄草根茎药材的质量。

由表3 结果还可以看出，分别从4 个主产区湖北省宜昌市木鱼镇（S5、S7）和湖北省神农架产区（S8、S9）的延龄草、吉林省长白山保护区池北区（S16、S17）和吉林省延边朝鲜族自治州安图县（S19、S20、S21）的吉林延龄草共9 批样品中3 种皂苷总含量分析，5年生药材3 种皂苷总含量明显高于4年生药材，而3年生药材指标成分的累积量远达不到药用需求，所以综合考虑栽培成本等因素可确定延龄草药材最佳采收年限为4年生或5年生。

表3 3 种主要成分含量测定( ＝3，mg·g)
Tab 3 Content determination of 3 main components ( ＝3，mg·g)

序号Y2TY3TY4T总含量S114.9613.584.6033.14 S226.7015.375.1947.26 S318.5113.734.4836.72 S410.7110.704.1525.56 S516.1413.865.0935.09 S621.0716.026.0043.09 S722.0115.905.1543.06 S818.7314.624.7238.07 S915.0012.314.0631.37 S1011.85 9.272.8423.96 S1116.1812.884.5733.63 S1227.6524.808.9561.40 S1322.1115.844.8842.83 S1417.7016.235.8139.74 S1518.4313.814.8537.09 S1619.7417.546.1843.46 S1719.6714.394.2838.34 S1819.0215.744.7539.51 S1920.4616.495.4242.37 S2012.1010.274.5426.91 S2127.6222.937.7558.30

2.4 统计分析

2.4.1 聚类分析（CA）以21 批延龄草根茎药材样品共有峰的峰面积为变量，使用SPSS 21.0 软件进行聚类分析。利用Z-得分进行数据标准化处理，采用ward 聚类方法和欧氏距离进行聚类分析，见图3。当欧氏距离为20 时，21 个产地聚为两类：S12、S19 和S21 聚成一类，其他聚为一大类；当欧氏距离为15 时，21 个产地聚为三类：S12 为一类，S19 和S21 聚成一类，其他聚为一大类；当欧氏距离为10 时，21 个产地聚为四类：S12 为一类，S19 和S21 聚成一类，S4、S20、S11 和S18 聚为一类，其他的聚为一类，说明S12、S21 和S19 号药材与其他组药材共有峰峰面积含量差异相对较大，其余不同产地的延龄草根茎药材样品间差异相对较小。

图3 21 批延龄草根茎药材样品聚类树状图Fig 3 Dendrogram of 21 batches of Trillium kamtschaticum rhizomes sample

2.4.2 主成分分析（PCA） PCA 是多元统计分析中使用最广泛的数据降维算法，它能够在降维模式下利用代表数据特征的不相关变量来描述样本，在无监督模式下根据数据主要成分特征进行分析。为更好地客观反映延龄草根茎药材之间的差异性，将21 批延龄草根茎药材样品共有峰的峰面积结果导入SIMCA 14.1 软件，进行PCA。采用UV 进行数据处理后，自动拟合PCA 模型，得到21 批延龄草药材的PCA 得分图，见图4。模型验证结果

R

X

（累计解释能力参数）＝0.965，

Q

（预计能力参数）＝0.635，

P

＜0.05，说明模型拟合能力较好，预测能力良好。通过PCA 分析可知，21 批样品明显可归为四类：S12 和S21 归为一类，S19 归为一类，S18 和S11 归为一类，其他的归一类，由主成分分析结果可见其与聚类分析结果具有一定相似性。

图4 21 批延龄草根茎药材样品的PCA 得分图Fig 4 PCA score of 21 batches of Trillium kamtschaticum rhizomes sample

2.4.3 正交偏最小二乘法判别分析（OPLSDA）为了更好地筛选21批延龄草根茎样品组间差异性代表成分峰，本研究在PCA 分析的基础上进行有监督的OPLS-DA 分析，选择OPLSDA 模型分析是因其能够在PCA 基础上增强组间分离情况，因为OPLS-DA 模型在为样品组间的差异提供最相关变量方面具有更大的可靠性。以21 批延龄草根茎药材指纹图谱的10 个共有峰峰面积为变量，采用SIMCA 14.1 软件进行OPLSDA 分析，结果见图5。模型验证结果

R

X

＝0.706，

R

Y

＝0.825，

Q

＝0.722，

P

＜0.05， 说明模型拟合能力较好，预测能力良好。结果显示21 批样品主要被分为两类，S12、S16、S17、S19和S21 产于吉林的吉林延龄草被t[1]轴分为同一类，其他的被分为一类，这与PCA 分析结果较为一致，通过VIP 筛选出导致延龄草根茎药材样品间差异的标志性成分，结果见图6，以VIP ＞1为筛选标准，标记出6 个差异较大的成分，差异大小依次为4、3、9、8、2、10 号色谱峰。经对照品比对指认出其中的8 号峰为Y4T、9 号峰为Y3T、10 号峰为Y2T，其结果与含量测定所选用的3 个主要指标成分互为验证，即延龄草中3 个指标成分总含量能较好地反映延龄草根茎药材的质量。

图5 21 批延龄草根茎药材样品的OPLS-DA 得分图Fig 5 OPLS-DA score of 21 batches of Trillium kamtschaticum rhizomes sample

图6 延龄草根茎药材HPLC 指纹图谱中10 个共有峰的VIP 得分图Fig 6 VIP score of 10 common peaks in HPLC fingerprint of Trillium kamtschaticum rhizomes sample

3 讨论

因延龄草药材须根成分含量和根茎有明显差异，有学者建议分开使用，本研究组前期研究也证实两个药用部位的质量差异性，故本文均统一选用延龄草根茎来进行分析。在样品提取过程中，试验分别比较了不同提取方法（加热回流和超声）、不同浓度提取溶剂（30%甲醇、70%甲醇、100%甲醇），考察了料液比（1∶25 和 1∶50）、药材用量（1.0 g 和2.0 g）对提取结果的影响。结果表明，选用1.0 g 药材用量、1∶50 料液比、70%甲醇回流提取120 min 时，可得到指纹图谱中色谱峰最多且峰面积最大的样品信息。同时，色谱条件的选择，分别对不同波长和流动相比例进行考察，发现延龄草皂苷类成分紫外吸收较弱，但在203 nm 附近有明显的紫外吸收，故选用203 nm 为检测波长。比较甲醇-水和乙腈-水系统洗脱，发现乙腈-水系统分离效果较好，洗脱时间为50 min。

目前对延龄草药材的质量评价方法主要有含量测定和指纹图谱方法，而综合分析的质量控制体系还不完善，尤其对于市场供应量最大的吉林延龄草。本文建立了延龄草根茎样品的指纹图谱结合主成分含量测定方法，综合分析评价药材质量。从药材HPLC 指纹图谱分析可知，9 号峰Y3T 是延龄草根茎药材的主要化学成分和特征性成分，该峰相对保留时间稳定，分离度良好，因此选择9 号峰作为参照峰。标定了10 个共有峰，用对照品指认了其中3 个主要色谱峰，并采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》对21 批延龄草根茎药材的HPLC 指纹图谱进行统计分析，相似度为0.824 ～0.972。结果表明，S8 号样品与对照图谱的相似度最高，而S12、S21 与其他样品存在一定差异。对延龄草根茎药材指纹图谱共有峰峰面积进行CA 和PCA 分析，除产自吉林的两批（S12、S21）延龄草根茎药材与其他产区样品略有差异外，大部分产区的延龄草根茎药材的质量较稳定。此外，OPLS-DA 分析结果显示4、3、9、8、2 和10 号色谱峰是影响延龄草根茎药材差异的主要标志性成分，目前本试验未获得峰4、3、2 的化合物信息，有待进一步开展研究，因此对8、9 和10 号色谱峰进行含量测定。结果显示3 种皂苷总含量最高的为S12 号样品（吉林靖宇），S21 仅次于S12（这也是S12 和S21 相似度较其他产地低的原因），含量最低的为S10 湖北省恩施苗族自治州的药材。在对4 个产区9 个不同年份样品中3 种皂苷总含量定量分析发现，皂苷含量5年生＞4年生＞3年生，所以综合考虑栽培成本等因素可确定延龄草药材最佳采收年限为4年生或5年生。

综上，不同产区及不同采收期延龄草根茎药材中甾体皂苷的含量存在一定差异，以吉林延龄草根茎药材中3 种皂苷总含量相对较高，也反映了市场上主流药材商品吉林延龄草的品质较好。同时本文建立的延龄草根茎药材HPLC 指纹图谱和含量测定方法重复性好，专属性强，可用于延龄草药材及相关制剂的质量评价。