张效铭，刘颖颖，崔红利，张春辉，薛金爱，季春丽，李润植

（山西农业大学农学院，太谷 030801）

工业现代化的发展和世界人口的剧增是全球温室气体浓度增加的主要原因。自工业革命以来，大气中CO2浓度已从大约0.55 mg/m3上升到现在的0.79 mg/m3［1］。直到今天，世界一次能源需求仍由化石燃料（如煤、石油、天然气等）满足，同时在未来的很长一段时间，化石能源还将继续在能源结构中占主导地位，这将导致化石燃料日益枯竭，CO2排放量持续增加。“碳达峰，碳中和”的任务目标已被提出。应对CO2排放这一问题的有效途径之一是以经济可行的形式对CO2进行生物固定并转化为高值产品，如生物柴油、多糖、活性蛋白等［2］。微藻长期以来被认为是唯一有潜力替代化石柴油的生物柴油来源，是减少温室气体的主要碳汇原料。微藻具有较高的生长速率和CO2固定能力，并富含多种高附加值产物，其CO2固定效率是C3植物的10～50倍。微藻还具有可利用发电厂烟道废气和其他工业尾气为无机碳源，利用市政废水和工农业生产废水为营养源（N、P等）等优点。因此，利用微藻固定烟气CO2联产高附加值产品构建低碳、绿色的资源化利用的新能源体系，被列为我国面向2050年能源可持续发展的潜力研究方向之一［3］。

然而，微藻生物固碳的CO2捕获率还比较低，这是因为CO2在微藻培养体系中吸收传质效率较低，而CO2传质过程是影响微藻生长及固碳效率的关键因素。而且大多数微藻在CO2体积分数高于5%时生长就会受到抑制，而工业烟气中CO2含量在10%～20%，严重限制了微藻规模化固定CO2和高值产物的积累［4-5］。因此，选育能耐受高浓度CO2的优良藻株、提高培养效率和降低培养成本是微藻固碳技术领域的首要任务。

近年来，国内外研究者在提高微藻CO2固定效率和产物积累方面做了广泛深入的研究。在藻液中添加CO2吸收剂可以有效地改善培养液的气体传质效率，缓解因高浓度CO2造成的培养液酸化问题，促进微藻的生长代谢，提高固碳效率。有研究者提出，在培养基中加入碳酸氢钠（NaHCO3），通过连续供应1%的CO2气体，可以提高小球藻的生长速率、CO2的利用率和油脂产率［6］。然而，大量碳酸盐的加入不仅增加微藻的培养成本，还会导致pH值上升，超过微藻的最佳培养要求。微藻细胞易受高盐度影响，从而不利于其生长，进而导致微藻同步高效固定CO2和积累代谢产物无法实现。将醇胺类化合物等化学吸收剂添加至微藻培养体系中可有效避免上述问题。醇胺类化合物的添加可以提高培养液初始pH及平衡稳定pH，使培养液具有pH缓冲能力。除此之外，其还可显著地提高培养液无机碳溶解度，并改变溶解性碳源形态的比例，提高CO2在培养液中的溶解传质能力，进而提高微藻固定CO2的效率和生物质产率。因此，醇胺类化合物在微藻培养体系中的应用因其高效性、可资源化和多藻适用性而受到广泛关注［7-9］。

本实验室从大同电厂附近水域分离纯化出一株生长速率快且能耐高浓度CO2的经自然环境酸驯化的优良小球藻种质。该藻种可以在高浓度CO2下持续生长，而在此条件下，添加化学吸收剂是否可以进一步提高该藻的固碳能力及生物量和产物积累还有待验证。因此，本文以大同电厂小球藻为研究对象，探讨在高浓度CO2下添加不同质量浓度的单乙醇胺（monoethanolamine，MEA）对微藻生长、油脂积累和光合活性等生理生化特征的影响，为深入理解微藻固碳机制和微藻高效固碳联产高值产品应用提供理论基础和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 藻株

试验所用小球藻Chlorellasp.为实验室从大同电厂附近水域筛选纯化所得，保藏于本实验室。

1.2 培养条件

将小球藻单藻落藻细胞接种于250 mL锥形瓶中，加入100 mL BG11培养基，将藻液放在连续光照强度为1 000 lx和温度为25℃的环境中培养。将处于对数生长期的50 mL藻液接种到装有600 mL BG11培养基的柱状光生物反应器中，使得接种后的藻液质量浓度为0.1 g/L。温度设置为25℃，光照强度为6 000 lx，CO2体积分数为20%，通气比为0.33，连续通气培养10 d，设置5组试验组，分别添加0、50、100、200、300 mg/L MEA，以 0 mg/L MEA为对照，每组设置3组平行。在接种后第2、4、6、8、10 d取样测定培养液pH、生物量、叶绿素荧光参数，在培养结束后测定色素和油脂含量。

1.3 生物量的测定

取一定体积的藻液V（mL），通过真空抽滤装置将其过滤到预先称好的质量为W0（g）的孔径为0.45 μm的醋酸-硝酸纤维混合微孔滤膜（使用前沸水煮3次并烘干）上，然后将滤有藻细胞的滤膜放在烘箱中烘干至恒重，称其重量记为W1（g）。根据公式（1）计算生物量密度C（ g/L）。

根据公式（2）计算生物量产率Poverall［g/（L·d）］。

C0（g/L）为初始生物量质量浓度；Ct（g/L）为培养结束后生物量质量浓度；t（d）为培养时间。

1.4 色素含量的测定

采用比色法测定微藻中色素的含量。取5 mL藻液 4 500 r/min 离心 10 min，弃上清液后向沉淀中加入与藻液等体积的95%乙醇，充分震荡后置于 75℃水浴锅水浴 15 min，冷却后 4 500 r/min离心10 min，用分光光度计测上清液在665、649和470 nm的吸光度（optical density，OD），根据公式（3～5）［10］计算藻细胞中叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素的质量浓度CChla、CChlb和CCa（rmg/L）。

根据藻液离心前的生物量密度以及加入量，可将各色素质量浓度换算成色素含量（mg/g，细胞干重）。

1.5 叶绿素荧光参数的测定

取3 mL藻液放入遮光比色皿，暗处理5 min后，使用Handy-PEA叶绿素荧光仪（Hansatech Instruments Ltd，英国）测定其相关光合参数——最大光能转换效率（maximum photochemical quantum yield of PSII，Fv/Fm）、实际光能转化效率［effective photo-chemical quantum yield of PSII，Y（Ⅱ）］、光化学淬灭系数（coefficient of photochemical fluorescence quenching，qP）和非光化学淬灭系数（non-photochemical quenching，NPQ）。测定光反应条件下Y（Ⅱ）'和光合有效辐射量（photo-synthetically active radiation，PAR）值，根据公式（6）计算相对电子传递速率（electron transport rate，ETR）值。各叶绿素荧光参数的含义如表1所示。

表1 叶绿素荧光参数Tab. 1 Chlorophyll fluorescence parameters

1.6 CO2固定率和CO2利用率的计算

根据公式（7）计算CO2固定率Fc［（g CO2/（L·d）］。

其中微藻生物量中的碳含量按50%估算［11］；12（g/mol）和44（g/mol）分别表示碳和CO2的相对分子质量。

根据公式（8）计算CO2利用率Ec。

V（L）为藻液体积；mc1（g/d）为每天通入培养基中CO2的质量；mc2（g/d）为每天通入培养基空气中CO2的质量。

1.7 总脂含量的测定

采用氯仿-甲醇萃取法测定微藻中的总脂含量。称取0.05 g左右的冻干藻粉A1（g）放入研钵并加入适量石英砂，在研钵中充分研磨后加入5 mL甲醇和2.5 mL氯仿，将混合物转移到50 mL离心管中，并高速振荡5 min使其均匀混合，然后将离心管密封置于37℃、转速为150 r/min的摇床24 h，之后取出离心管8 000 r/min离心5 min，收集上清液到新的离心管中；再向沉淀管中加入5 mL甲醇和2.5 mL氯仿，高速震荡5 min后置于37℃摇床2 h，取出后再次离心，并取上清与之前收集的上清液合并。观察藻渣颜色，如未抽提干净，再重复上述步骤1～2次。向合并的上清液中加入5 mL氯仿和9 mL 1% NaCl溶液，漩涡震荡混匀，保证最终体系为V（甲醇）∶V（氯仿）∶V（1% NaCl）=2.0∶2.0∶1.8。将混合液8 000 r/min离心 10 min，将下层有机相转移至另一预先称重A2（g）的玻璃管中，用氮吹仪在60℃下将溶液吹干，待氯仿挥发干净后，再将玻璃管置于55℃真空干燥箱中烘干3 h，冷却后称其重量A3（g），根据公式（9）、（10）计算总脂含量TL（%）和产率PLipid［（mg（/L·d）］。

1.8 统计分析

2 结果与分析

2.1 不同质量浓度MEA对培养基pH的影响

培养液pH是影响微藻生长及CO2高效固定的重要因素。为了研究不同质量浓度的MEA在20%CO2条件下对生物培养基pH的影响，本文测试了藻液pH随时间的变化趋势（图1）。培养第0天时，不添加MEA的培养基在通入20% CO2后，pH下降到了5.35，随着添加MEA质量浓度的增加，pH也随之升高，MEA质量浓度为300 mg/L时，pH升高到6.22。随着培养时间的增加，藻液pH在不加MEA和加入低质量浓度的MEA（50 mg/L）时呈现随时间逐渐上升的趋势，而加入较高质量浓度的MEA（＞50 mg/L）时，藻液pH随时间呈现先下降后上升的趋势。但整体而言，加入MEA后藻液的pH在高浓度CO2下波动范围有所减小，由常规培养时的5.35～6.87（0 mg/L MEA）缩小为5.81～6.44（300 mg/L MEA）。

图1 不同质量浓度MEA对藻液pH的影响Fig. 1 Effects of different mass concentrations of MEA on the pH in the culture medium

2.2 不同质量浓度MEA对小球藻生长、固碳效应及油脂积累的影响

干重是表征藻细胞生长情况的重要指标。从图2可以看出：当MEA质量浓度由0 mg/L增加至100 mg/L时，小球藻生物量比对照显著提高；当MEA质量浓度为50 mg/L时，培养10 d的小球藻干重达到最大值3.07 g/L，是对照组生物量的1.44倍；而MEA质量浓度为200和300 mg/L时，培养10 d的小球藻生物量分别为2.08和1.63 g/L，较对照分别降低了2.5%和23.3%。这表明，适宜质量浓度的MEA可促进小球藻在高浓度CO2下的生长，而高质量浓度MEA却会抑制小球藻的生长。

图2 不同质量浓度MEA对小球藻干重的影响Fig. 2 Effects of different mass concentrations of MEA on the dry weight of Chlorella sp.

在不同质量浓度MEA的作用下，小球藻对CO2固定效率差异显著。如表2所示，小球藻在0～100 mg/L的MEA条件下，CO2固定效率显著上升，MEA质量浓度为50 mg/L时，CO2固定效率和CO2利用率达到最大值，分别为0.55 g/（L·d）和0.27%，比对照组分别提高了44.7%和42.1%。当MEA质量浓度提高至200～300 mg/L时，CO2固定效率较对照组显著下降，且随着质量浓度的升高呈下降趋势。这说明，适宜质量浓度的MEA在微藻培养体系中可提高小球藻的CO2固定效率和利用率。

表2 不同质量浓度MEA培养的小球藻的最大生物量（Ct）、总生物量生产率（Poverall）、CO2固定率（Fc）和CO2利用率（Ec）Tab. 2 The maximum biomass concentration (Ct), overall biomass productivity (Poverall), CO2 fixation rates (Fc) and CO2 utilization efficiency(Ec) of Chlorella sp. under different MEA mass concentrations

油脂是微藻重要的代谢产物之一，添加适量质量浓度的MEA可显著增加微藻中的油脂含量，油脂产率也有较为显著的提升。如图3所示，当MEA质量浓度为50 mg/L时，油脂含量达到最大值23.5%，油脂产率达到71 mg/（L·d），分别比对照组高21.7%和77.5%。

图3 不同质量浓度MEA对小球藻总脂含量和产率的影响Fig. 3 Effects of different mass concentrations of MEA on the lipid content and productivity of Chlorella sp.

2.3 不同质量浓度MEA对小球藻色素积累和光合特性的影响

MEA的添加对小球藻的色素积累和光合特性也会产生一定的影响。从图4可以看出，随着MEA质量浓度的升高，小球藻的色素积累呈现先上升后下降的趋势。从色素质量浓度来看，在50 mg/L的MEA质量浓度下色素积累最多，叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素的质量浓度分别为23.6、9.2和6.9 mg/L，分别是对照组的1.42、1.51和1.35倍。当MEA质量浓度继续增加时，色素积累呈现下降趋势，在200和300 mg/L MEA质量浓度下，色素积累量相比对照组明显下降，当MEA质量浓度为300 mg/L时，叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素的含量分别比对照组下降了40.0%、37.8%和46.9%。从色素含量来看，在50 mg/L的MEA质量浓度下色素含量最多，叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素的含量分别为7.7、3.3和2.4 mg/g，分别是对照组的1.11、1.18和1.04倍，当MEA质量浓度为300 mg/L时，叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素的含量分别比对照组下降了18.8%、15.7%和30.8%。

图4 不同质量浓度MEA对小球藻色素质量浓度的影响Fig. 4 Effects of different mass concentrations of MEA on pigment content of Chlorella sp.

不同质量浓度的MEA对小球藻光合特性的影响如图5所示，在培养的第0天（通入CO2后），Y（Ⅱ）和qP趋近于0，Fv/Fm值为0.50左右，低于正常值0.65，而NPQ值较高。这是因为高浓度CO2对小球藻的生长有抑制作用。小球藻通过提高热耗散保护处于胁迫下的光合作用系统，经过2 d的延滞期后，其光合活性逐渐恢复。第4天小球藻的叶绿素荧光参数和ETR达到最高，随后逐渐降低。就整体趋势而言，添加50和100 mg/L MEA的小球藻光合活性要高于对照组，而添加200和300 mg/L MEA的小球藻叶绿素荧光参数低于对照组。MEA质量浓度为50 mg/L时，小球藻的光合活性最强，固碳的电子传递速率最快，Fv/Fm、Y（Ⅱ）、qP和ETR值达到最大，说明适量质量浓度的MEA可以提高小球藻的光合活性。

图5 不同质量浓度MEA对小球藻叶绿素荧光参数的影响Fig. 5 Effects of different mass concentrations of MEA on chlorophyll fluorescence parameters of Chlorella sp.

3 讨论

3.1 MEA对藻液pH的影响

pH是影响微藻生长和CO2生物固定的重要生理参数，这是因为pH决定了培养基中用于微藻生长碳源的形态比例分布和浓度［12-13］，其中和 CO2是微藻代谢优先吸收的碳源［14］。小球藻培养的理想pH接近中性（7.00～8.00），而本试验对照组的pH值在5.20左右时（图1），小球藻依然可以正常生长。从大同电厂附近水域分离得到的小球藻Chlorellasp.比其他小球藻更耐高浓度CO2，即使在酸性更高的培养基中也能保持生长，这可能是因为该藻株是从排放酸性废气废水的电厂附近分离出来的，生境的特殊性决定了其对高浓度CO2和酸性环境具有更强的适应性。pH还会调控培养基中营养元素（如磷酸盐、铁和铵等）的形态，这同样是影响微藻生长代谢的原因之一［15-16］。图1的pH变化趋势表明，添加50 mg/L MEA的处理组pH值维持在5.7左右，因此，添加适当质量浓度的MEA可使培养液具有pH缓冲能力，使培养液pH维持在适宜微藻生长的范围内，为微藻创造有利的生长环境。

3.2 MEA对小球藻生长、固碳效应及油脂积累的影响

醇胺类化合物作为一类具有优异的吸收活性和高效的CO2脱除效率的化学吸收剂颇受关注［17］，在微藻固碳领域也被广泛应用。王兆印等［18］和Cardias等［19］研究发现，添加适当浓度的二乙醇胺（diethanolamine，DEA）可以提高培养液的气液传质系数，增大CO2气液传质速率，从而使藻细胞生物量和CO2固定效率较未添加DEA的对照组提高25.6%和41.2%。孙中亮［20］研究了MEA、DEA、三乙醇胺（triethanolamine，TEA）、N-甲基二乙醇胺（N-methyldiethanolamine，MDEA）对二形栅藻（Scenedesmus dimorphus）生长的影响，结果表明，添加MEA、DEA、TEA、MDEA与对照（0.62 d-1）相比，生长速率均有提高，分别为0.65、0.63、0.66和0.65 d-1。与其他醇胺类吸收剂相比，MEA与培养基中的CO2发生反应更有利于碳酸氢盐离子的稳定生成［21］，从而进一步促进微藻的生长。本研究结果显示，添加适宜质量浓度的MEA对小球藻的生长有促进作用，且CO2固定效率和CO2利用率均得到显著的提升。但高质量浓度的MEA对小球藻的生长却产生抑制作用（图2），这与Rosa等［8］的研究结果相似。其研究结果显示：添加100和200 mg/L的MEA对ChlorellafuscaLEB 111生长有抑制作用 ；在300 mg/L MEA的条件下，生物量质量浓度在培养1 d后就开始下降。这可能是由于培养体系中高质量浓度MEA会与CO2反应生成过量的有毒中间体氨基甲酸酯及MEA本身的胺腐蚀效应所致，其反应原理如下所示。反应（1）是MEA与CO2在物质的量的比为2∶1的条件下反应生成氨基甲酸酯的步骤，反应（2）是氨基甲酸酯中间体的水解步骤，生成碳酸氢盐离子

碳向微藻生物质组分的转化取决于培养环境和条件，如CO2浓度、温度、光照强度和营养元素浓度等。通常情况下，微藻在营养缺乏等不利环境条件胁迫下，其细胞倾向于将具有更高能量密度的脂质作为一种长期的能量储存形式［23-24］。本研究结果显示，在 CO2体积分数为20%的条件下，添加50和100 mg/L的MEA时，小球藻的油脂含量都要高于对照，高碳环境和化学吸收剂的联合作用可能会对微藻培养体系造成一定程度的胁迫，从而改变微藻细胞内油脂代谢途径，使其积累更多的油脂。有研究表明：在高碳条件胁迫下，参与合成油脂的丙酮酸脱氢酶（pyruvate dehydrogenase complex，PDHC）和乙酰辅酶A羧化酶（acetyl coA carboxylase，ACC）相关的基因表达均有所上调；中间产物丙酮酸盐能更多地转移到丙二酰辅酶A和丙二酰载体蛋白上，与短碳链反应生成长碳链，强化了脂肪酸合成途径，从而使微藻中油脂含量增加［25］。Zhu等［26］研究了在15% CO2下聚乙二醇200（polyethylene glycol 200，PEG200）对微拟球藻积累油脂的影响，结果表明，1 mmol/L PEG200浓度下脂质产量达到最大值0.44 g/L。PEG200的加入会提高微藻生长前期的比生长速率，导致培养液氮缺乏，氮饥饿胁迫环境会促进微藻细胞油脂的积累。

3.3 MEA对小球藻色素积累和光合特性的影响

微藻培养体系中CO2浓度对微藻生长代谢具有重要的影响［27］，适当的CO2浓度有利于微藻对培养体系中无机碳的光合同化，从而促进微藻生长和代谢产物的积累，而高浓度的CO2会抑制小球藻的光合作用。CO2的体积分数超过10%对大部分的微藻生长具有抑制作用［28］，这可能是由高浓度CO2导致细胞质酸化造成的。而细胞内的酸化可能是由碳酸酐酶（carbonic anhydrase，CA）失活导致的，CA是微藻CO2浓缩机制（CO2-concentrating mechanism，CCM）的关键限速酶，具有维持酸碱平衡、CO2及碳酸盐转运等功能［29］。在高浓度CO2条件下，CA活性受到抑制［30］，胞内酸碱度失衡，进而导致卡尔文循环中碳同化速率降低。

在微藻生长过程中，藻体颜色的变化是其生理变化的宏观体现。为了探究在高碳环境下不同MEA质量浓度对小球藻光合作用的影响，本研究首先对小球藻色素积累进行了测定。色素是植物光合作用的基础，其含量的高低可反映植物光合功能的强弱［31-32］。微藻细胞体内的色素种类可依据在光合作用过程中的作用分为捕光色素和光保护色素。叶绿素a、叶绿素b为捕光色素，可以将吸收的光能有效地传递到相关的反应中心转化为化学能，而类胡萝卜素作为光保护色素可将剩余能量吸收，避免膜体受伤，从而达到光保护作用，通过光合作用产生的色素含量的多少可以判断藻类的生理状态［33-34］。本研究结果表明，不同质量浓度的MEA造成了小球藻色素含量产生较大差异，在50和100 mg/L MEA条件下，色素含量较无MEA处理组有所提高，而200和300 mg/L MEA的添加却抑制了小球藻色素的积累。

为了进一步探究在高浓度CO2条件下MEA对小球藻光合作用的影响，我们对其叶绿素荧光参数进行了测定。叶绿素荧光分析技术是分析植物光合活性及外界因素对其产生影响的鉴定技术［35］，能在一定程度上反应藻细胞的光合活性和固碳电子传递效率状况。常见的叶绿素荧光参数有Fv/Fm、Y（Ⅱ）、qP、NPQ和ETR等。在正常条件下，Fv/Fm值变化幅度较小，且不受物种和生长条件的影响，受到胁迫时该值显著降低［36］。本研究发现，MEA的添加会影响微藻的光合特性，添加50和100 mg/L MEA可以缓解高浓度CO2对微藻光合造成的抑制作用。但随着MEA质量浓度的进一步升高，微藻的光合活性却有所下降，Fv/Fm、qP、Y（Ⅱ）、ETR值逐渐降低，表明高质量浓度的MEA使光系统的开放程度和电子传递效率降低，吸收、捕获及传递电子的能力减弱。MEA与CO2反应生成的氨基甲酸酯是一类基于受体结构的光合作用光系统Ⅱ抑制剂，其作用靶标是质体醌还原前的PSⅡ与PSⅠ之间QA与PQ间的电子传递体β蛋白，氨基甲酸酯与其结合后会改变蛋白质的氨基酸结构，抑制电子从束缚性质体醌QA向质体醌QB传递，影响光合电子传递，从而影响藻细胞光合活性［37-38］。而NPQ值逐渐增大，微藻吸收的能量一部分用于光合作用，一部分多余的能量以热能的形式耗散掉［39］，此现象利于保护光合结构，使得藻细胞对胁迫环境做出了一定的自我保护，增加对胁迫环境的适应性［40］。

利用微藻固定并转化CO2是控制烟气碳排放和缓解温室效应的一项非常有前景的技术。选育可耐受高浓度CO2的藻种是实现微藻固碳产业的首要前提，在此基础上，进一步提高微藻固碳效率和高效积累微藻碳代谢产物是推动微藻固碳联产高附加值产品产业化应用的关键。本试验以在火力发电电厂附件自然水域中筛选获得的一株可耐高浓度CO2的小球藻（Chlorellasp.）为研究对象，研究了添加不同质量浓度化学吸收剂MEA对小球藻生长、生理和油脂积累的影响。研究结果表明，添加MEA可以缓解因高浓度CO2造成的培养基酸化现象，在50 mg/L的MEA处理下，小球藻生物量、油脂含量及产率、固碳效率均显著升高。因此，基于化学吸收剂的微藻生长代谢及固碳性能强化策略是同时实现生物能源生产与废气资源化利用的有效途径。但化学吸收剂在强化微藻固碳方面的具体作用机制，如化学吸收剂强化作用下微藻细胞内部固碳代谢途径变化、微藻固碳动力学研究及不同吸收剂间的协同作用机理等尚不清楚，在今后的工作中应针对这些问题进行多角度逐层揭示。