张瑞麟，杜 超，鞠雪莹，吴玉雯，臧延青

(黑龙江八一农垦大学食品学院，大庆 163319)

油茶为山茶属多年生乔木，普遍种植于浙江、江西、河南等南方高山和丘陵地带[1-3]，是世界四大可食用油源树种之一，也是我国特有的一种可食用油源树种[2,4]。据报道油茶籽粕年产量达39.71万t[5]，营养物质含量丰富，可广泛应用于化工、轻工、食品、饲料等领域[6]，但仍然存在处理不当直接丢弃的现象，造成极大的资源浪费与环境污染问题。

多糖是在单糖之间形成糖苷键的线性或支链的高聚物[7]，为油茶籽粕中的主要成分，占15%～30%[5]。已有研究人员从茶粕多糖中分离纯化出木糖、葡萄糖醛酸、半乳糖胺和甘聚糖，并证明其具有抗氧化、降血糖、抗肿瘤、抗凝血、减肥和消炎镇痛等多种生物活性[7]，因此在结构和功能上都具有很高的研究价值，已成为近些年的研究热点。

目前，关于植物多糖的提取方法有溶剂提取法、超临界流体萃取法、超声波辅助提取法、微波辅助提取法和酶解法等[8]。超声辅助提取时会产生高剪切力，加速细胞壁破碎速度，增加溶剂渗透作用，缩短提取时间，提高提取率[9]。油茶籽粕是油茶产业链的副产物，产量巨大，且活性成分含量较为丰富，其所含茶粕多糖的生物活性较强，是开发功能性食品的高质量资源。为发挥不同产地油茶籽的自身营养价值，对其进行品质研究和主要活性成分的含量测定具有重要意义。郭玉华等[2]研究表明油茶籽粕多糖的结构为甘露糖和葡萄糖，徐迪等[5]对油茶籽粕多糖提取工艺优化。但对不同地区和不同品种油茶籽粕多糖提取率与抗氧化活性的比较研究鲜有报道。为充分了解不同产地、不同品种的油茶籽的营养价值，本研究选取产自江苏省宿迁市的长林系列油茶籽、福建省建宁县的红花油茶籽和浙江省衢州市的普通白花油茶籽为原料，优化油茶籽粕多糖的提取工艺，并评价其抗氧化活性。以期进一步提高油茶籽利用率和经济价值，研发相关功能性食品，为不同品种油茶籽粕资源的精深开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

长林系列油茶籽，江苏省宿迁市；红花油茶籽，福建省建宁县；普通白花油茶籽，浙江省衢州市。

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH试剂)、乙醚、三氯乙酸、硫酸亚铁、抗坏血酸(VC)、邻苯三酚、邻羟基苯甲酸、过氧化氢、三羟甲基氨基甲烷：分析纯。

1.1.2 仪器与设备

KH3200DE型数控超声波清洗器，TD4A型台式离心机，V5100型可见分光光度计。

1.2 实试验方法

1.2.1 油茶籽的预处理

油茶籽→烘干→脱壳→粉碎→乙醚索氏回流→油茶籽粕。

1.2.2 油茶籽粕多糖的提取

参考郝继伟[10]、杨卫等[11]方法并略做修改。将已预处理的油茶籽粕与无水乙醇均匀混合以去除多余油脂，通风晾干后加入一定料液比的蒸馏水，利用超声波进行辅助处理，离心去除沉淀。向上清液中加入一定量三氯乙酸静置过夜，离心后去除沉淀，加入95%乙醇(4倍体积)于4 ℃冰箱中静置过夜，经离心获得的乳白色沉淀，沉淀干燥即为油茶籽粕多糖。3种油茶籽粕多糖分别为：长林系列油茶籽粕多糖(长林)，红花油茶籽粕多糖(红花)，普通白花油茶籽粕多糖(白花)。

1.2.3 油茶籽粕多糖提取率

称量脱脂干燥后油茶籽粕质量(m0)和干燥后油茶籽粕多糖质量(m1)，计算油茶籽粕多糖提取率公式为：

(1)

式中：Y为油茶籽粕多糖提取率/%；m0为脱脂干燥后油茶籽粕质量/g；m1为干燥后油茶籽粕多糖质量/g。

1.2.4 油茶籽粕多糖提取的单因素实验

以蒸馏水为浸提溶剂利用超声波辅助提取油茶籽粕多糖，以不同功率、温度、时间、料液比四个单因素进行实验。实验条件如表1所示，使用式(1)计算油茶籽粕多糖提取率。

表1 单因素实验水平

1.2.5 正交实验设计

以单因素实验结果为基础，使用L9(34)正交实试验对油茶籽粕多糖的提取条件做优化处理，选择的合适水平如表2所示。

表2 正交实验因素水平

1.2.6 油茶籽粕多糖体外抗氧化活性的测定1.2.6.1 对DPPH自由基清除能力实验

参考李欣欣等[12]的方法略作修改。取2 mL不同浓度的多糖样品溶液，加入1 mmol/L DPPH乙醇溶液，震荡均匀，25 ℃避光静置50 min，记录517 nm处吸光度值，以VC为对照，每组重复3次，使用式(2)计算清除率。

(2)

式中：E为自由基清除能力/%；A0为蒸馏水与DPPH溶液的吸光度；A1为样品与DPPH溶液的吸光度；A2为样品与2 mL无水乙醇溶液吸光度。

1.2.6.2 对OH·自由基清除能力实验

参考马超等[13]的方法略作修改。配制6 mmol/L的FeSO4、H2O2和水杨酸溶液。取1 mL不同浓度的多糖样品溶液，加入1 mL FeSO4和1 mL水杨酸溶液然后加入1 mL H2O2，震荡均匀，水浴37 ℃避光反应1 h，记录510 nm处吸光度值，用VC作为对照，每组重复3次，按式(3)计算清除率。

(3)

式中：E为自由基清除能力/%；A0为蒸馏水与自由基的吸光度；A1为样品、FeSO4溶液、水杨酸溶液和H2O2溶液混合后的吸光度；A2为水杨酸溶液换成蒸馏水与自由基的吸光度。

参考Li等[14]的方法略作修改。取0.4 mL不同浓度的多糖样品溶液，加入1.84 mL Tris-HCl缓冲溶液(pH=8.1)，混合均匀后，37 ℃水浴10 min，再加入0.16 mL的邻苯三酚溶液，震荡均匀，静置4 min后加0.5 mL浓硫酸终止反应，记录325 nm处吸光度值，用VC作为对照，每组重复3次，按公式4计算清除率。

(3)

式中：E为自由基清除能力，%；A0为蒸馏水与自由基的吸光度；A1为样品与自由基的吸光度。

1.3 数据处理

采用Excel 2010软件，进行数据分析处理。

2 结果与分析

2.1 油茶粕多糖提取率单因素实验

2.1.1 超声波功率对多糖提取率的影响

由图1得知，超声波功率对油茶籽粕多糖的提取率有较明显的影响。超声波功率在60～90 W之间对3种油茶籽粕多糖提取率的影响是呈现正相关。随着超声波功率的提高，多糖提取率的增加趋势越明显，超声波功率在80～90 W之间，多糖提取率上升趋势最大，90 W时油茶籽粕多糖提取率最高。而在100 W时，3种油茶籽粕多糖提取率出现下降的情况。出现这种问题可能是当超声波的功率增加，使得油茶籽粕传质作用效果增加，油茶籽粕多糖溶解度增加的同时，过高频率的超声波振动导致溶解出的多糖部分降解[15]。从而使超声波功率在100 W时，油茶籽粕多糖的提取率降低。在相同超声波功率作用下，长林提取率最高，红花和白花提取率次之。综上选取90 W左右为实验超声波功率，故将80、90、100 W作为后续实验考查水平。

图1 不同超声波功率下3种油茶籽粕多糖提取率

2.1.2 提取时间对多糖提取率的影响

由图2得知，提取时间对油茶籽粕多糖的提取率有较明显的影响。提取时间在25～55 min之间，3种油茶籽粕多糖提取率与提取时间呈正相关，即油茶籽粕多糖提取率随提取时间变长而提高，45 min到55 min多糖提取率上升最明显，在55 min时提取率达到峰值。但65 min后，油茶籽粕多糖提取率出现下降的现象。原因可能是超声波作用时间过长，会使部分多糖溶解出来后长时间受到机械剪切力作用反被破坏[16]。在相同提取时间下，长林提取率最高，红花和白花提取率略低。因此，选取55 min左右为实验提取时间，故将45、55、65 min作为后续实验考查水平。

图2 不同提取时间下3种油茶籽粕多糖提取率

2.1.3 温度对多糖提取率的影响

由图3得知，提取温度在45～55 ℃之间时，3种油茶籽粕多糖提取率与提取温度呈现正相关，即油茶籽粕多糖提取率随提取温度增加而增长，因为随着提取温度升高，分子运动加快，有利于多糖分子析出至溶剂。提取温度在65 ℃以上3种油茶籽粕多糖提取率有不同的变化，白花提取率开始下降，另两种多糖提取率少量上升，在75 ℃后长林和红花提取率出现下降。出现多糖提取率下降的原因可能是多糖在高温情况下分解或高温使溶剂蒸发严重进而影响提取率[7]。在相同提取温度作用下，长林提取率在3种多糖中最高，红花和白花提取率略低。因此，选取65 ℃左右为实验提取温度，故将55、65、75 ℃作为后续实验考查水平。

图3 不同提取温度下3种油茶籽粕多糖提取率

2.1.4 料液比对多糖提取率的影响

由图4得知，料液比在(1∶10)～(1∶20)之间对3种油茶籽粕多糖提取率的影响呈现正相关，即油茶籽粕多糖提取率随提取温度增加而增长，当料液比超过1∶20后3种油茶籽粕多糖提取率趋于稳定。说明提取液在这个范围内传质作用已经达到平衡，不会继续随着料液比增加而增加。在相同料液比作用下，长林提取率最高，其次为红花提取率，最次为白花提取率。选取1∶20左右为实验料液比，故将1∶15、1∶20、1∶25作为后续实验考查水平。

图4 不同料液比下3种油茶籽粕多糖提取率

2.2 正交实验分析

由表3得知，根据R分析长林、红花和白花提取率的影响因素从主到次排列是∶C(提取温度)>D(料液比)>A(超声波功率)>B(提取时间)。由k值大小得出结论，油茶籽粕多糖最优提取工艺为A2B3C3D3，即超声波功率90 W，提取时间65 min，提取温度75 ℃，料液比1∶25。但提取时间影响最小且提取时间过长会导致提取率下降，故结合实际情况，油茶籽粕多糖最优提取工艺为A2B2C3D3，即超声波功率90 W，提取时间55 min，提取温度75 ℃，料液比1∶25，在此条件下油茶籽粕多糖的提取率为长林(14.08±0.23)%、红花(14.03±0.32)%和白花(13.11±0.21)%。

表3 L9(34)正交实验设计及结果

2.3 抗氧化活性实验

2.3.1 对DPPH自由基清除能力

具有抗氧化活性的物质通过供氢将紫色的DPPH自由基还原成黄色的二苯肼，故DPPH自由基清除率常用于体外抗氧化实验的研究[17]。由图5得知，样品质量浓度在1.0～5.0 mg/mL之间内，3种油茶籽粕多糖质量浓度越高，对DPPH自由基清除率越大，表现为良好的量效关系，且相同质量浓度时对DPPH自由基清除能力接近。长林、红花和白花质量浓度为5.0 mg/mL时，3种多糖对DPPH自由基的清除率分别为78.88%、78.51%和71.56%。3种油茶籽粕多糖对DPPH自由基清除能力由强到弱依次为长林>红花>白花。

图5 3种油茶籽粕多糖对DPPH自由基清除曲线

2.3.2 对OH·自由基清除能力

在机体中OH·自由基能穿透生物膜，严重破坏生物分子引发机体疾病，故OH·自由基清除率常用于体外抗氧化实验的研究测[17]。由图6得知，样品质量浓度在1.0～5.0 mg/mL之间，3种油茶籽粕多糖对OH·自由基清除率随多糖质量浓度的增加而增加。3种油茶籽粕多糖质量浓度为5.0 mg/mL时，红花、长林和白花，对OH·自由基清除率分别为，67.92%、65.60%和59.65%。3种油茶籽粕多糖对OH·自由基清除能力由强到弱依次为红花>长林>白花。

图6 3种油茶籽粕多糖对OH·自由基清除曲线

图7 3种油茶籽粕多糖对自由基清除曲线

3 结论

通过正交实验对超声辅助提取3种油茶籽粕多糖的工艺进行优化，得到最佳的提取条件为：提取温度75 ℃，料液比1∶25，超声波功率90 W，提取时间55 min。长林的提取率最高，为(14.08±0.23)%。3种油茶籽粕多糖都具有较强的抗氧化活性，且自由基清除能力与多糖质量浓度呈正相关，同种油茶籽粕多糖对不同类型自由基的清除能力不同，但3种油茶籽粕多糖均对DPPH自由基具有显著的清除效果。与其他品种相比，长林的提取率最高且对自由基清除能力最强，这可能与产地气候和土地成分等因素有关，其深层次原理有待进一步探究。