陈平亚，吴山楠，何翠华，张亮亮，吴少荣，王绥家，吴毓浪

（海口海关技术中心，海南海口 570311）

对虾急性肝胰腺坏死病（acute hepatopancreatic necrosis disease，AHPND）是由携带毒力质粒弧菌导致的水产病害，2010 年首次发现于我国和越南境内，随后相继出现于马来西亚、泰国、墨西哥和菲律宾等国，曾在我国南方地区的对虾养殖场大面积暴发[1]。斑节对虾（Penaeus monodon）、凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）、中国明对虾（Fenneropenaeus chinensis）、日本囊对虾（Marsupenaeus japonicus）均可患病。通常在放苗后7～35 d 内大规模发病，死亡率高达100%。患病对虾肝胰腺萎缩且表面出现黑色斑点和条纹，甲壳变软，尾扇及附肢变为淡蓝色，空肠、空胃或肠道内食物不连续，在肝胰腺、腮、肠道、肌肉等组织中均能检测到病原[2]。

AHPND 最初由副溶血弧菌的特定毒力株（VpAHPND）引起。与普通的副溶血弧菌基因相比，该类菌株携带了数个69 kb 的毒力编码质粒pVA1。该质粒携带的致病基因能编码PirA、PirB毒素蛋白，而PirB 毒素决定菌株致病力，PirA 相对较弱[3]。有研究[4]将含pirA和pirB基因的pVA1质粒转化到非致病的弧菌中，证实该弧菌也能够引起AHPND，而自然缺失pirA和pirB基因的VpAHPND突变菌株不能导致对虾患病。敲除Pir 毒素基因后，致病菌失去致病力，而基因回补后，可再次获得致病力[5]，因此推断Pir 毒素是AHPND 的主要致病因子。根据目前的报道[6]，弧菌属中的欧文氏弧菌（V.owensii）、哈维氏弧菌（V.harveyi）和坎贝氏弧菌（V.cambellii）均可携带pVA1 质粒，并引起对虾患AHPND。因此，根据pVA1 质粒中pirB基因设计探针和引物，对VpAHPND进行检测具有特异性。

重组酶介导等温扩增（recombinase acid amplification，RAA）是利用重组酶以及DNA 聚合酶、单链结合蛋白（SSB）进行恒温核酸扩增的技术，不需要热循环过程。首先引物与重组酶结合形成复合体，在SSB 的参与下，在与引物同源的序列处使双链DNA 解旋，SSB 防止单链DNA 复性，模板DNA 解链并使引物与模板配对，然后在DNA聚合酶的作用下，完成链的延伸，整个反应可在35 min 内完成。重组酶在常温下就能打开DNA 双链，若在荧光RAA 反应体系中加入荧光探针，即可实现荧光信号的实时监测，使检测结果可视化。此外，RAA 技术还能够完成多重实时扩增，在同一个反应体系里检测多个目的基因[7]。

本研究针对pVA1 质粒pirB基因设计特异性引物和探针，建立了快速、灵敏的荧光RAA 检测方法，并应用于对虾组织器官样本中AHPND 病原菌检测，以期为AHPND 病原菌的快速检测提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株 供试菌株包括VpAHPNDHK190423 株、单增李斯特菌（Listeria monocytogenes）、粪肠球菌（Enterococcus faecalis）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、福氏志贺氏菌（Shigella flexneri）、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、大肠埃希氏菌（Escherichia colt）、阪崎肠杆菌（Enterobacter sakazakii）、伤寒沙门氏菌（Salmonella enteritidis）、溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）、河流弧菌（Vibrio fluvialis）、创伤弧菌（Vibrio vulnificus），由海口海关技术中心动物实验室分离保存。

1.1.2 对虾样品 从海口市、文昌市及周边对虾养殖场采集样品，包括42 份凡纳滨对虾、36 份斑节对虾和48 份中国明对虾。

1.1.3 主要试剂 引物及探针，由上海生工公司合成；荧光型核酸扩增试剂（RAA 法），购自杭州众测生物科技有限公司。

1.1.4 主要仪器 ZB-32-1 实时荧光恒温检测仪，购自南宁壮博生物科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1pirB基因特异性引物、探针设计 从GenBank 上获得pirB基因序列，应用Primer 6.0 软件设计引物和探针。引物 pirB F：5'-CGAGCATTACCAATCTATTGAGT-3'；pirB R：5'-ACAACAAATGTTCGATCATCTG-3'。探针：5'-CGCTTACATTAAATATGTTGATGTTATTGCCAA（FAM-dT）GG（THF）CC（BHQ1-dT）GAAGCAATTGATCG-3'（其中FAM 为荧光报告基团，THF 为四氢呋喃残基，BHQ1 为荧光淬灭基团，序列3'端加上C3 spacer 修饰）。引物和探针，由上海生工公司合成。

1.2.2 荧光PCR 扩增 PCR 扩增使用水产行业标准《急性肝胰腺坏死病诊断规程》（SC/T 7233—2020）推荐引物和方法。引物F：5'-TTGGACTGTCGAACCAAACG-3'；R：5'-CGACCCCATTGGTATTGAATG-3'。TaqMan探针：5'-FAM-AGACAGCAAACATACACCTATCATCCCGGATAMRA-3'。荧光PCR 反应体系（25.0 μL）：Probe qPCR Mix 12.5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.75 μL，探针（10 μmol/L）0.25 μL，模板（100 ng/μL）1.0 μL，用灭菌水补足至25.0 μL。反应程序：95 ℃ 20 s；95 ℃ 3 s、60℃30 s，45 个循环，每个循环结束后收集荧光信号。

1.2.3pirB基因质粒载体构建 采用 Primer 6.0引物设计软件，设计带酶切位点的特异性引物。F：5'-CGGGATCCATGACTAACGAATACGTTGTAAC-3'（划线部分为BamHI 酶切位点）；R：5'-CCGCTCGAGCTACTTTTCTGTACCAAATTCATCG-3'（划线部分为XhoI 酶切位点）。以VpAHPNDHK190423 株DNA 为模板进行PCR 扩增。反应体系（25.0 μL）：2×PremixTaq12.5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1.0 μL，模板2.0 μL，ddH2O 8.5 μL。扩增程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃30 s，72 ℃15 s，40 个循环；72 ℃ 3 min。将含有目的基因的PCR 扩增产物和pMD18-T 质粒载体，同时用限制性内切酶XhoI 和BamHI 酶切，再用T4 连接酶连接到pMD18-T 质粒载体中连接成重组质粒，然后将其转化到大肠杆菌感受态DH5α 中，涂在含氨苄青霉素钠的LB 琼脂平板上，37 ℃倒置培养24 h 后挑单菌落接种到LB 液体培养基中，置摇床震荡培养16 h，经质粒提取试剂盒回收、纯化后测序。将测序结果正确的重组质粒作为阳性对照。按照重组质粒拷贝浓度计算公式，拷贝浓度（copies/μL）=质粒质量浓度（g/μL）×6.02×1023/质粒相对分子质量，质粒相对分子质量=碱基对的平均相对分子质量（660）×重组质粒总碱基对数（3 864），测得拷贝浓度为8.2×107copies/μL。将其进行10 倍梯度稀释，即8.2×（107～101）copies/μL，以此为模板分别进行RAA 扩增和PCR 扩增，检测荧光信号。

1.2.4pirB基因实时荧光RAA 反应条件 以8.2×107copies/μL 克隆质粒为模板，参照商品化荧光RAA 试剂盒说明书，建立VpAHPND的RAA检测体系。反应体系为50.0 μL：加入A 缓冲液（PEG35000 水溶液）40.9 μL，上下游引物（10 μmol/L）各2.0 μL，探 针（10 μmol/L）0.6 μL，B 缓冲液（乙酸镁水溶液）2.5 μL，DNA 模板2.0 μL。配置好反应体系后，盖上管盖，充分混匀，低速离心后迅速将反应管放置于恒温扩增仪中反应。

1.2.5 荧光RAA 灵敏度、特异性、重复性试验对已知拷贝浓度的PMD18-pirB 重组质粒载体进行10 倍梯度稀释，以各梯度浓度质粒为模板进行荧光RAA 方法检测，确定该方法对pirB基因的最低检出限；以VpAHPND-HK190423 株、粪肠球菌、单增李斯特菌、副溶血弧菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、福氏志贺氏菌、阪崎肠杆菌、溶藻弧菌、伤寒沙门氏菌、创伤弧菌、河流弧菌、哈氏弧菌等作为对照菌株，用去离子水作为空白对照，采用SC/T 7233—2020 推荐的荧光探针PCR 检测法作为平行对照，验证荧光RAA 法检测pirB基因的特异性；取8.2×103copies/μL 浓度的pMD18-T-pirB 重组质粒进行荧光RAA 试验，设计8 次组内重复，测Ct 值并计算其平均值和标准差（S）及其变异系数（CV），以变异系数（标准偏差/重复值的平均数）评估该方法的重复性。

1.3 模拟样品荧光RAA 检测方法的应用

对虾感染试验采用浸泡感染，空白对照组使用灭菌海水浸泡对虾样品。将菌株VpAHPNDHK190423 株接种至胰蛋白酶大豆肉汤（TSB）培养基中 100 r/min、28 ℃摇菌培养12 h；将培养好的菌液5 000 r/min 离心5 min，收集沉淀，用灭菌海水重悬。取42 份凡纳滨对虾、36 份斑节对虾和48 份中国明对虾样品，采用菌株VpAHPNDHK190423 株菌悬液进行浸泡感染，浸泡感染24 h后换灭菌海水养殖。对濒死对虾肝胰腺组织进行取样，每种对虾分别取0.5 g 肝胰腺组织于1.5 mL 离心管中，加入0.5 mL 灭菌生理盐水研磨匀浆，提取总DNA 作为模板。用建立的荧光RAA 检测方法和SC/T 7233—2020 推荐的荧光探针PCR 法同时进行检测，并对检测结果进行比较。

2 结果

2.1 克隆载体构建

以提取的VpAHPND菌株DNA 为模板，将经PCR扩增获得的目的基因片段用琼脂糖凝胶电泳，获得pirB基因条带；回收纯化目的基因片段和pMD18-T 质粒载体后，用T4 连接酶连接后转化到感受态细胞DH5α 中，涂板培养24 h；挑选阳性菌落摇瓶培养，收集菌体后，提取重组质粒pMD18-T-pirB，同时用限制性内切酶BamHI 和XohI 进行酶切后电泳，结果出现1 条约1 200 bp 的目的片段和1 条约2 700 bp 的克隆载体片段，说明阳性质粒构建成功。

2.2 荧光RAA 灵敏度

用去离子水将拷贝浓度为8.2×107copies/μL的pMD18-T-pirB 质粒作10 倍系列稀释，用稀释后的模板进行荧光RAA 检测，以确定该方法最低检出限。结果（图1）显示，在8.2×101copies/μL质粒浓度时，仍出现扩增曲线，表明该检测方法至少能检测到8.2×101copies/μL，达到了SC/T 7233—2020 推荐的荧光PCR 法检测灵敏度。

2.3 荧光RAA 特异性

用建立的荧光RAA 检测方法对VpAHPNDHK190423 株、单核细胞增生李斯特菌等病原菌进行检测，结果只有VpAHPND-HK190423 株出现了扩增曲线，而单核细胞增生李斯特菌等其他对照菌株和空白对照没有出现扩增曲线（图2），说明荧光RAA 法对VpAHPND的检测具有特异性，检测结果与SC/T 7233—2020 推荐的荧光PCR 法检测结果一致。

2.4 荧光RAA 重复性

对样品进行重复性试验，选取8.2×103copies/μL浓度的pMD18-T-pirB 克隆质粒进行8 次重复的荧光RAA 试验及荧光PCR 检测。结果（图3）显示：荧光RAA 试验变异系数是0.41%，表明重复性良好，稳定性强；而SC/T 7233—2020 推荐的荧光PCR 法变异系数是0.51%，重复性略低于荧光RAA 方法。

2.5 人工感染样品检测

应用建立的荧光RAA 方法对采集到的3 种对虾样品进行菌悬液浸泡感染后做荧光RAA 检测，共检出阳性样本35 份，且阳性样本对虾具有AHPND 临床症状和组织病理学特征。将荧光RAA 扩增结果为阳性的对虾肝胰腺组织加入到含3%氯化钠的碱性蛋白胨水液体培养基中，37 ℃增菌培养6 h，按照GB 4789.7—2013 方法进行划线分离及生化鉴定，确定检出的阳性样品感染了VpAHPND。SC/T 7233—2020 推荐的荧光PCR 方法与荧光RAA 方法检测3 种对虾的检测结果符合率为100%，说明该方法检测对虾临床样本具有很高可靠性。

3 讨论

近年来，研究证明非副溶血弧菌也可以引起对虾患AHPND。2015 年Kondo 等[8]分离出可致病的携带pVA1 质粒的欧文氏弧菌，并证实这株欧文氏弧菌能导致养殖对虾患AHPND；2017年，Dong 等[9]从发病对虾中分离到1 株可表达毒力蛋白PirAB 的坎贝氏弧菌，其能够导致对虾患AHPND；2018 年，Restrepo 等[10]分离出可引起AHPND 的浦那弧菌，该菌也携带有pVA1 质粒。pVA1 致病质粒可以在种间通过接合平行传播，也可在垂直方向稳定遗传给子代细胞，并可在子代中永久遗传[11]。AHPND 致病菌可以是携带pVA1 质粒的副溶血弧菌，也有可能是携带pVA1 质粒的坎贝氏弧菌、欧文氏弧菌、浦那弧菌等病原菌，因此应该用建立的RAA 检测方法对携带pVA1 质粒的坎贝氏弧菌、欧文氏弧菌、浦那弧菌也进行检测验证，但因缺少这几种试验菌株，未进行相关试验，待以后补充。

试验过程中，取病虾肝胰腺组织在含3%氯化钠的碱性蛋白胨水液体培养基中增菌，再提取DNA 进行荧光RAA 扩增结果呈弱阳性，而直接取病虾肝胰腺组织提取DNA 进行荧光RAA 扩增结果曲线正常。这可能是因为增菌过程中肝胰腺组织中的VpAHPND在传代中PVA1 质粒丢失所致。

目前已有多种核酸检测方法应用于AHPND检测，例如PCR 扩增方法及环介导等温扩增技术（LAMP）。常规PCR、荧光定量PCR 和巢式PCR 扩增等方法对仪器和环境要求较高，且检测时间较长，难以在基层推广应用。LAMP 作为一种核酸等温扩增技术，其反应灵敏度高于PCR 检测方法，且荧光染料法可以直接通过肉眼观察反应结果，但LAMP 反应产物是一些序列长度不等的片段，不能进行测序验证，只能用于判断是否有扩增条带[12]。当然，RAA 检测方法也存在不足之处，其扩增体系中存在大量蛋白酶，应用电泳分析结果前须纯化去除蛋白质[13]。荧光RAA 方法与LAMP法相比所需时间更短，无需昂贵的PCR 仪器，只需要一台能收集荧光信号的恒温装置，且灵敏度与荧光PCR 相当，同时还能完成多重扩增[14]，可使用恒温荧光检测系统，也可结合测流试纸条法检测，具有广阔的应用前景。

综上，本试验根据质粒pVA1 中pirB基因序列设计探针和引物，建立的对虾AHPND 病原菌荧光RAA 扩增检测方法，灵敏度高、特异性强、重复性好、操作步骤简单，可用于水产养殖中对虾样品AHPND 的检测。