刘 萌，刘昆昂，刘振国，马 宏，张根伟，胡向东，赵宝华**

（1．河北师范大学生命科学学院，河北 石家庄 050024；2．河北省科学院生物研究所，河北 石家庄 050081）

平菇隶属于担子菌门（Basidiomycota） 层菌纲（Hymenomycetes） 伞菌目（Agaricales） 侧耳科（Plenrotaceae） 侧耳属（Pleurotus）[1]。目前已知的侧耳种类有100多种。平菇对环境的适应能力强，分布广泛，成为我国广泛栽培的食用菌，因其菌盖似贝壳或舌状，故又称耗菌，也称为北风菌、冻菌、天花蕈等[2]。

平菇的传统生产中，多数平菇品种为低温型和中温型，可用于夏季栽培的高温型平菇相对较少，且部分高温型菌株对高温环境的适应能力较弱且并非真正的耐高温品种，其出菇温度无法满足夏季的栽培要求。所以，高温型菌株尤其是耐高温菌株的缺乏是制约平菇夏季生产的现实问题[3]。虽然可供平菇育种选择的方法包括选择、杂交和基因转化等[4-6]，但以食用为目的的栽培品种平菇选育方法方面需要慎重选择。欧洲的现行法规（European Directive 2001/18/CE） 认为遗传转化和诱变处理产生的菌株不符合“自然或安全过程”原则[7]。因此，将亲本单核菌株交配融合产生新双核菌丝体的杂交育种方式成为选育平菇优良菌株的首选方法[6-8]。筛选杂交菌株时，为提高筛选效率，直接将可亲和组合置于高温出菇环境，将无法在高温出菇的组合淘汰。期望在育种研究中选育出具有抗杂菌污染、优质、高产的高温型平菇菌株，提高平菇生产的经济效益。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

供试平菇菌株科佳1号、江都71均来源于河北省科学院生物研究所保藏。

科佳1号为广温型平菇菌株，菌丝生长温度为5℃～35℃，最适为22℃～25℃；出菇温度为4℃～28℃，最适为6℃～25℃；产量高于江都71；对高温耐受能力弱于江都71[9]。试验中科佳1号单孢菌株编号以A表示。

江都71为夏季主栽的高温平菇品种，出菇温度为12℃～36℃；产量低于科佳1号；对高温环境的适应性强于科佳1号[10]。单孢菌株编号以JD表示。

1.2 供试培养基

PDA培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g，水1 L（制备固体培养基时加入琼脂12 g）。

培养料配方：棉籽壳93%、麦麸5%、石灰2%，含水量65%。

1.3 平菇单核菌丝的制备

将供试菌株科佳1号和江都71转接于PDA平板上，置于25℃生化培养箱中培养，待菌丝长满后，接种到菌袋（培养料）中，各菌株接种15袋，置于25℃菇房中培养。待菌袋中的菌丝长满形成原基后，进行出菇管理。选择菇型完整，大小适中，无病虫害，约八成熟的子实体，放入平皿中收集孢子。向上述收集孢子的平板内加入少量灭菌的蒸馏水充分混匀后，吸取1 mL移入试管内，混匀后进行稀释，稀释梯度为 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，进行单孢菌株分离[11]。然后每个梯度吸取0．1 mL孢子悬液移入PDA平皿内涂布均匀，设置5个重复，25℃培养，挑取单菌落移至新的PDA平皿上25℃培养。

1.4 平菇耐高温新品种选育

挑选上述单孢分离的2个亲本的单核菌丝，两两配对组合分别接种于同一PDA平皿中，2个接种块间距2 cm，置于恒温培养箱培养至菌丝接触时，将交界处的菌丝接入PDA平皿中培养。当菌丝生长至半径3 cm左右时，用显微镜观察是否有锁状联合，若有锁状联合则为杂交成功[12]。将镜检选出的杂交菌株接入栽培袋中25℃培养至满袋，后置于30℃和35℃培养箱中交替培养，选择能在此温差下出菇的杂交子进行组织分离。

1.5 高温型平菇菌丝阶段初筛

1．5．1 不同温度下平菇杂交子菌丝生长速度测定

将上述试验筛选的平菇杂交子接入装有35 mL PDA培养基、直径为9 cm的培养皿中，25℃培养至满皿后，用直径为0．5 cm的打孔器打孔制备菌饼。将菌饼接入定量PDA培养基平板中央，分别置于30℃、35℃恒温培养箱中培养，每个处理设3个重复。3天后划线，记录菌丝生长天数和菌落半径，计算菌丝生长速度。菌丝生长速度（V，%）的计算公式为：

式中：S为菌落半径（cm）；D为菌丝生长天数（d）。

1．5．2 平菇杂交子抗木霉能力测定

分别将筛选得到的平菇杂交子和木霉接入装有35 mL PDA培养基、直径为9 cm的平板中，25℃培养至满皿后，用直径为0．5 cm的打孔器打孔制备菌饼。将菌饼接种到距离中心1．75 cm处，25℃培养3 d，后对称接入木霉菌饼，25℃培养3 d。观察、记录菌丝生长及拮抗情况，测量拮抗线的宽度、菌丝生长半径，每个处理设3个重复。

1.6 高温型平菇杂交子与亲本的亲和性试验

将筛选得到的平菇杂交子经平皿培养活化后，用直径5 mm打孔器制备供试菌株菌的菌饼接种于PDA培养皿（直径9 cm）上。每个平皿上分别接种杂交菌株和亲本菌株，菌饼分布呈三角形，菌饼间两两相距2 cm左右。接种完成后用封口膜将平皿封口，置于25℃生化培养箱，培养7 d左右观察菌丝生长交界处拮抗反应情况，每个处理设3个重复。

1.7 高温型平菇杂交子的分子鉴定

1.7.1 高温型平菇杂交子的DNA提取

使用天根植物基因组DNA提取试剂盒提取选育出的高温型平菇杂交子的基因组DNA。

1.7.2 高温型平菇杂交子的ISSR鉴定

参照食用菌菌种真实性鉴定ISSR法对供试菌株进行鉴定[13]。所用引物序列见表1。

表1 ISSR分析所需引物序列Tab.1 Primer sequences of ISSR analysis

PCR 反应的总体积为 20 μL：10 μL 2×Taq PCR StarMix with Loading Dye （GenStsr），7 μL ddH2O，2 μL引物，1 μL模板DNA（所有待测DNA样品均将浓度统一为10 ng·μL-1）。PCR反应程序设置为：94℃预变性4 min；94℃变性30 s，参考各条引物的Tm值，在Tm值基础上温度增加5℃复性45 s，72℃延伸2 min，设置35个循环；72℃延伸7 min，4℃保存。每个引物扩增的条带以0、1统计建立数据库，在相同迁移位置上（相同分子量片断），有扩增带记为1，无扩增带记为0，以2次试验结果为准。所有获得的数据建立一个二进制矩阵数据库，借助统计软件包NYSYS-PC 2.1对数据进行分析，使用 UPGMA（unweighted pair-group method with arithmetic averages） 方法进行 Jaccard’s coefficient的计算和系统进化树的构建[14]。

1.7.3 高温型平菇杂交子的ITS鉴定

使用真菌ITS序列通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′） 对筛选出的高温型平菇杂交子进行扩增。PCR反应体系为50 μL，PCR反应体系：5 μL 2× EasyTaq PCR SuperMix（TRANS）、正反向引物分别加入2.5 μL、2.5 μL DNA模板，用水补至50 μL。PCR扩增条件为：94℃预变性5 min；94℃变性30s，56℃复性30 s，72℃延伸1.5 min，共35个循环；72℃延伸10 min；4℃保存。使用MEGA 6软件进行序列比对，以邻位连接法（neighbor-joining method，NJ） 进行聚类分析，Bootstrap值为1 000，构建系统发育树[15]。

1.8 数据分析

使用SPSS 22数据处理软件进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 耐高温平菇品种的选育

从栽培试验所得子实体中挑选大小合适、无虫害、干净、完整的子实体，经孢子稀释培养，平菇杂交子的镜检结果见图1。

图1 平菇杂交子的镜检Fig．1 Microscopic examination of Pleurotus ostreatus hybrids

参照图1镜检，去除生长缓慢、菌丝稀疏和菌落生长不规则等不良单孢菌株后，科佳1号共获得11个优良单孢菌株，江都71共获得14个优良单孢菌株。将两亲本单孢菌株两两配对杂交，共154个组合，镜检确定具有锁状联合的菌株22个。

高温环境平菇杂交子的出菇情况见图2。

图2 高温环境下平菇杂交子的出菇情况Fig．2 Fruiting situation of Pleurotus ostreatus hybrids under high temperature environment

如图2所示，22个菌株中有8个菌株可在30℃和35℃高温环境出菇，将这8个菌株分别标号为PZ1、PZ2、PZ3、PZ4、PZ5、PZ6、PZ7、PZ8。其中PZ1、PZ2、PZ3、PZ4、PZ6为浅色品种，其余为深色品种；PZ1、PZ4、PZ8菌柄较短，其余菌柄较长；PZ3、PZ6子实体单生，其余丛生。对此8个菌株进行组织分离，为后续试验提供供试纯化菌株。

2.2 不同温度下平菇杂交子菌丝生长速度

筛选出的平菇杂交子及亲本菌株在温度为30℃和35℃条件下的生长速度见表2。

表2 平菇杂交子在30℃和35℃条件下菌丝的生长速度Tab．2 Mycelial growth rate of Pleurotus ostreatus hybrids at 30℃and 35℃

由表2所示，Duncan多重比较分析发现供试菌株30℃和35℃时生长速度均有显著差异。

30℃时，菌株PZ1的菌丝平均生长速度最快，快于2个亲本，且差异显著；菌株PZ1、PZ2、PZ3、PZ6、PZ7菌丝平均生长速度均快于2个亲本，其中菌株PZ1、PZ2、PZ7菌丝平均生长速度均明显快于2个亲本，差异显著，但3个菌株间差异不显著；菌株PZ3、PZ6菌丝平均生长速度虽快于2个亲本，但均与江都71差异不显著，PZ6菌丝平均生长速度显著高于科佳1号。

在35℃时菌株PZ1、PZ3、PZ5、PZ6菌丝平均生长速度快于2个亲本，其中PZ3、PZ6明显快于2个亲本，差异显著；PZ1、PZ5菌丝平均生长速度虽显著高于江都71，但与科佳1号相比不显著，根据显著性结果分析与科佳1号可归为一类。

2.3 平菇杂交子菌丝抗木霉能力

木霉（Trichoderma spp．）会影响其平菇的生长，平菇生长的不同阶段都会受到木霉危害，影响其产量，因此要筛选出抗木霉能力强的优良品种至关重要，平菇亲本与杂交菌株的抗木霉能力测定结果见表3。

表3 平菇亲本与杂交菌株抗木霉能力测定Tab．3 Determination of resistance to Trichoderma spp．of Pleurotus ostreatus parent and hybrid strain

由表3可知，不同杂交菌株对木霉的拮抗能力不同，大部分的菌株都有抗木霉的能力；拮抗线的宽度越窄，说明抗木霉能力越强。PZ2、PZ3、PZ4、PZ5和PZ8的抗木霉能力强；PZ1的抗木霉能力介于2个亲本之间，强于江都71，但弱于科佳1号；PZ5的抗木霉能力最强，但与木霉接触后菌丝生长能力弱于亲本和其他杂交菌株。

2.4 平菇杂交子与亲本菌株的拮抗试验

选育出的平菇杂交子与亲本的拮抗反应见图3。

图3 平菇杂交子与亲本的亲和性Fig．3 Compatibility between Pleurotus ostreatus hybrids and their parents

如图3所示，各杂交菌株均与双亲表现出明显的抗性，其中PZ2、PZ4与科佳1号拮抗明显，与江都71拮抗现象不明显。

2.5 平菇杂交子ISSR分析

用表1中的40条核苷酸引物对亲本及杂交菌株菌丝进行扩增。其中P14、P16、P19、ISSR1、ISSR2、ISSR3、ISSR4、ISSR5、SSRI6、ISSR7、ISSR8、ISSR9、ISSR10、ISSR11、ISSR12，15 条引物能扩增出条带，条带清晰且具多态性的带谱，扩增片段大小在100 bp～5 000 bp。每条引物扩增的DNA片段条带数在1条～7条，15条引物扩增的平均条带数为 13．2 条。

15条引物共扩增DNA片段198条，差异性条带178条，多态性片段占总数的89．9%，证明筛选的引物对平菇菌株DNA扩增的条带多态性丰富、稳定，可以用于亲缘关系的分析。重复序列ISSR指纹分析构建的系统发育树见图4。

图4 基于供试菌株的重复序列ISSR指纹分析构建的系统发育树Fig．4 Phylogenetic tree constructed based on repeated sequence ISSR fingerprinting of test strains

由图4可以看出，供试菌株的相关系数在0．48～0．86。在0．64水平左右，可以聚为3大类。其中，江都 71、PZ1、PZ2、PZ4、PZ5、PZ6、PZ7、PZ8 聚为第一类，PZ3聚为第二类，科佳1号为第三类。基本可以得出在杂交种与亲本的亲缘关系中，江都71与所有的杂交子在亲缘关系上较科佳1号更近；PZ4、PZ5、PZ6、PZ7、PZ8的关系较其他菌株更近；PZ1和PZ2与大部分杂交子相比亲缘关系较远。

2.6 平菇杂交子ITS序列分析

基于ITS序列构建的侧耳属系统发育树见图5。

图5 基于ITS序列采用邻位连接法获得的侧耳属系统发育树Fig.5 Pleurotus phylogenetic tree obtained by neighbor-joining method based on ITS sequences

如图5所示，10株菌株可以分成2个大分枝，菌株科佳1号较其他菌株差异较大；而在其余的9株菌株组成的另一枝中，菌株江都71和菌株PZ1和菌株PZ2、PZ3、PZ4分成2枝，说明这2个菌株较其余菌株其ITS区差异性较高，而菌株江都71和菌株PZ1亲缘关系较近。该系统发育树虽与ISSR结果不同但也验证了杂交子代与亲本中的江都71亲缘关系更近。

3 讨论与结论

为提高育种效率，对亲本菌株进行两两组合杂交后在30℃和35℃的高温环境进行出菇试验，排除大量不符合育种目标的杂交菌株，获得8个可在高温环境下出菇的菌株。结果表明，在筛选高温菌株时，直接将杂交试验菌株置于高温环境进行出菇验证，可大量减少后期筛选鉴定工作量，大幅提高育种效率。后期在对杂交菌株与亲本的菌丝进行性能比较时发现，所有可在高温下出菇的菌株在高温条件下酶活性、对木霉抗性、生长速度等方面均优于亲本。综合比较杂交菌株和亲本菌丝在高温环境下的表现，发现PZ5在菌丝生长速度明显弱于亲本，但随温度升高其他指标大幅度提高，且增长比率较高，说明其拥有很高的后期提升潜力，可进一步与亲本进行杂交改良。杂交菌株与亲本的菇农艺性状比较结果表明，PZ1和PZ7在实验室条件下栽培出菇的子实体外观明显优于亲本。上述试验证明了在杂交育种选择亲缘关系较远的亲本，有可能获得与亲本相比更优秀的杂交子代。