徐艳梅，韩彬，郝丽娟，高燕霞，张素平

(河北省药品医疗器械检验研究院，石家庄 050200)

阿奇霉素为十五环含氮大环内酯类抗生素，是新型红霉素的最具代表的药物之一[1-2]，由克罗地亚的普利瓦(Pliva)制药公司在20 世纪70 年代末开发[3-5]，合成路线是以红霉素A 原料，经过肟化、贝克曼重排、还原和甲基化反应得到最终产物[6]。

盐酸羟胺是合成关键中间体——红霉素A 肟的主要原料，未反应完全的盐酸羟胺有引入药物的可能，属于潜在杂质。已报道盐酸羟胺结构的物质具有遗传毒性和致基因突变作用[7-9]，致突变机理是改变DNA 的胞嘧啶结构，导致DNA 复制时碱基配对错误而诱发基因突变。依据欧洲共同体药物评审委员会(EMEA)、人用药品委员会(CHMP)《遗传毒性杂质限度指导原则》和人用药品注册技术要求国际协调会(ICH)的指导原则M7 《评估和控制药物中DNA 反应的(诱变的)杂质以限制潜在的致癌风险》与M7(R1)《评估和控制药物中DNA 反应性(致突变)杂质以限制潜在致癌风险》的相关要求，应对阿奇霉素原料中残留的盐酸羟胺进行测定，依据《化学药物质量标准建立的规范化过程技术指导原则》(CPH1-1)和《化学药物杂质研究的技术指导原则》(CPH3-1)中描述：“与已知毒性杂质结构相似的杂质，亦被认为是毒性杂质”的规定，因此本方法仍然按照毒性物质日允许暴露量为2 μg/d 限度进行控制。

然而盐酸羟胺在紫外光区无特征吸收，较难进行测定。目前常用的检测技术主要有借助氧化还原反应原理的滴定法[10]及复杂衍生化操作的间接分光光度法[11-14]等，其专属性不强，易受其它类似化合物干扰——尤其是具有相近性质的杂环仲胺盐，同时精密度和灵敏度较差，不适用于痕量羟胺的检测。离子色谱法近年来在分析化学领域的应用已日趋成熟，特别是在针对强极性、水溶性好、可电离的有机离子化合物分析方面表现出了独特的优势[15-17]。笔者建立了一种操作简单、专属性强、灵敏度高、重复性好的离子色谱法，用于阿奇霉素中痕量盐酸羟胺残留的检测。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

离子色谱仪：DIONEX ICS-5000 型，配备安培检测器(ED)和双泵系统(淋洗液单泵和柱后衍生AXP 泵)，美国赛默飞世尔科技公司。

电子天平：XS205 型，感量为0.01 mg，梅特勒-托利多科技(瑞士)有限公司。

阿奇霉素原料药样品：批号分别为A20190503、A20190504、A20190505。

盐酸羟胺对照品：批号为100496-200801，纯度(质量分数)为100.0%，中国食品药品检定研究院。

甲基磺酸(MSA)：纯度(质量分数)为99.5%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

氢氧化钠溶液：质量分数为50%，美国赛默飞世尔科技公司。

实验用水为超纯水，电阻率为18.2 MΩ·cm。

1.2 溶液配制

盐酸羟胺对照品储备液：20 μg/mL，精密称取盐酸羟胺109.21 mg，置于50 mL 容量瓶中，用10 mmol/L MSA 溶解并定容，精密量取1 mL，置于50 mL 容量瓶中，用10 mmol/L MSA 稀释至标线，摇匀。

盐酸羟胺对照品溶液：0.2 μg/mL，取盐酸羟胺对照品储备液0.5 mL，置于50 mL 容量瓶中，用水稀释至标线，摇匀。

阿奇霉素样品溶液：取阿奇霉素原料药0.25 g，精密称定，精密加入5 mL 水，振摇30 s，过0.22 μm滤膜。

阿奇霉素样品加标溶液：取阿奇霉素样品约0.25 g，精密称定，置于10 mL 容量瓶中，用0.2 μg/mL 盐酸羟胺对照品溶液溶解并稀释至标线，摇匀。

MSA 溶液：30 mmol/L，精密量取MSA 0.967 mL，精密加入500 mL 水。

1.3 色谱条件

色谱柱：IonPac CS16 阳离子交换分析柱(250 mm×4 mm，美国赛默飞世尔科技有限公司)，IonPac CG16 阳离子交换保护柱(50 mm×4 mm，美国赛默飞世尔科技有限公司)；柱温：35 ℃；淋洗液：30 mmol/L MSA 溶液，等度洗脱，流量为0.8 mL/min；进样体积：25 μL；衍生试剂：500 mmol/L NaOH 溶液，流量为0.2 mL/min；检测器：电化学检测器，电极材料为金电极，参比电极为pH-Ag/AgCl电极；检测器温度：30 ℃；电位波形：积分脉冲安培检测，6 电位波形，安培电位波形表见表1。

表1 安培电位波形表

2 结果与讨论

2.1 淋洗液浓度的选择

在离子色谱分析过程中，淋洗液的组成、浓度及流量等都对出峰情况具有较大影响。其中，淋洗液的浓度对离子的保留时间影响较大，淋洗液浓度越大，保留时间越短，因此需要对淋洗液浓度进行考察，以选择较为合适的浓度。笔者对不同淋洗液浓度进行了考察，以色谱峰形、理论塔板数为指标，考察了淋洗液浓度对检测结果的影响。试验结果表明，当淋洗液浓度为20 mmol/L 时，色谱峰有较明显前延；当淋洗液浓度为30 mmol/L 和40 mmol/L 时峰形良好，故选择淋洗液浓度为30 mmol/L。

2.2 淋洗液流量的选择

淋洗液流量对于离子的保留时间也有较大影响，流量增大可缩短分析时间，但亦会影响色谱峰形，因此合适的淋洗液流量是进行分析不可缺少的前提。试验考察了淋洗液流量分别为0.7、0.8、0.9 mL/min 时的色谱峰形。结果表明，当流量为0.8 mL/min 时色谱峰形较好，因此选择淋洗液流量为0.8 mL/min。

2.3 柱温的选择

柱温对于色谱峰保留时间具有显著影响，不同离子在柱温变化时呈现出不同的变化趋势。为得到较好的色谱峰形及合适的保留时间，对柱温进行了试验考察，以色谱峰形、理论塔板数为指标，分别考察比较了柱温为25、35、45 ℃时的检测结果，表明盐酸羟胺的测定受柱温影响不大，故选择更易实现的35 ℃作为柱温。

2.4 专属性

以实验用水作为空白溶液，在优化的色谱条件下，分别分析空白溶液、盐酸羟胺对照品溶液及阿奇霉素品加标样品溶液，记录色谱图，结果如图1～图3。由图1～图3 可知，盐酸羟胺色谱峰峰形较好，且样品分析无干扰。

图1 空白溶液色谱图

图2 阿奇霉素加标样品溶液色谱图

图3 盐酸羟胺对照品溶液的色谱图

2.5 线性关系

分别精密量取盐酸羟胺对照品储备溶液0.01、0.1、0.5、1.0、3.0、5.0、10.0 mL，分别置于7 只50 mL容量瓶中，用水稀释至标线，配制成盐酸羟胺质量浓度分别为0.004、0.04、0.2、0.4、1.2、2.0、4.0 μg/mL的系列标准工作溶液。精密量取上述溶液各25 μL，分别注入离子色谱仪，记录色谱图，以色谱峰面积为纵坐标，以盐酸羟胺质量浓度ρ(μg/mL)为横坐标进行线性回归，得到回归方程：y=28.523 7ρ-0.366 6，相关系数(r)为0.999 9。结果表明，盐酸羟胺在0.004 2～4.2 μg/mL 范围内线性关系良好。

2.6 定量限与检出限

精密量取阿奇霉素对照品溶液逐级稀释并测定，直至信噪比约10，即为定量限溶液。精密量取定量限溶液3 mL，置于10 mL 容量瓶中，加水稀释至标线，摇匀，即为检出限溶液。分别取定量限溶液和检出限溶液注入离子色谱仪，连续测定6 次，记录色谱图。结果表明，羟胺的定量限和检出限分别为0.207 ng/mL 和0.062 ng/mL。

2.7 加标回收与精密度试验

精密称取阿奇霉素原料药0.25 g，共9 份，置于5 mL 容量瓶中，分别精密加入盐酸羟胺对照品储备溶液25、50、75 μL 各3 份，加水振摇30 s，用水定容至标线，过滤。精密量取上述溶液注入离子色谱仪，记录色谱图，测得量与加入量的比值即为回收率，结果列于表2。由表2 可知，盐酸羟胺的回收率为94.50%～100.46%，相对标准偏差为1.9%。说明本方法符合验证要求，准确度良好。

表2 加标回收与精密度试验结果

2.8 稳定性试验

取新鲜配制的盐酸羟胺对照品溶液和阿奇霉素加标溶液，于室温放置0、1、2、3、4 h，精密量取不同放置时间的上述溶液注入离子色谱仪，记录色谱图，色谱峰面积测定结果见表3。由表3 可知，对照品溶液及阿奇霉素加标样品溶液放置4 h 时盐酸羟胺色谱峰面积分别降低10.4%及10.1%左右，这提示盐酸羟胺在水溶液中不稳定，样品溶液宜临用新制。

表3 对照品与样品溶液稳定性试验

2.9 强制破坏试验

取阿奇霉素原料药样品，分别在酸、碱、加热、光照和氧化条件下，按照表4 方法进行强制降解试验，按照1.2 项下方法制备溶液，所得溶液注入离子色谱仪，记录色谱图，色谱图如图4～图8 所示。由图4～图8 可知，阿奇霉素降解产物对盐酸羟胺的测定无干扰。

表4 破坏实验方法

图5 碱破坏试验色谱图

图6 热破坏试验色谱图

图7 光破坏试验色谱图

图8 氧化破坏试验色谱图

3 结语

建立了离子色谱-电化学法测定阿奇霉素中残留的盐酸羟胺的方法，通过调节淋洗液浓度及流量，获得了最佳淋洗液条件，可对盐酸羟胺进行准确定量。该法具有良好的线性、准确性和重现性，检出限低。本方法具有较好的实用价值，对测定药物中残留的盐酸羟胺具有一定的借鉴作用。