苏 锐， 李英健， 刘 鹏， 赵恩宏

(承德医学院附属医院胃肠外科， 河北 承德 067000)

LYN是Src家族酪氨酸激酶(SFK)的成员，SFK是众多信号途径的关键信号转导中间体，这些信号途径参与细胞多种生理功能，如增殖、分化、自噬和细胞凋亡[1]。本研究利用临床验证的手段分析LYN在胃癌中的表达，然后通过降表达LYN观察其对胃癌细胞系生物学表型的影响，明确LYN在胃癌中的生物学功能，包括增殖和凋亡等，分析LYN对胃癌的调控机制。以期为研究胃癌的恶性进展机制和我国胃癌患者的个体化、精准化治疗提供新的理论依据。

1 资料与方法

1.1临床资料:收集73例我院2017年1月至2018年5月接受外科手术的胃癌患者组织标本及癌旁组织标本。

1.2主要试剂、仪器及细胞株:人胃癌细胞系AGS购自上海中科院细胞库，血清来自美国Gibco公司；Lipofectamine2000脂质体来自Invitrogen公司；BCA蛋白定量试剂盒BCA Protein Assay Kit来自北京康为世纪生物科技有限公司；蛋白Marke来自TaKara公司；ECL显影液来自美国PTG公司；CCK8-kit来自北京索莱宝公司；相关一抗及二抗来自美国Sigma公司；CO2恒温细胞培养箱来自Eppendorf公司；稳压稳流电泳仪来自北京六一电泳仪器厂；YD-AB生物组织摊烤片机来自益迪医疗设备有限公司；4℃/-20℃/-80℃冰箱来自青岛海尔公司；iMark多功能酶标仪来自Bio.Red公司。

1.3免疫组化方法检测LYN在胃癌及癌旁组织中的表达:组织标本进行常规处理，脱水，石蜡包埋，连续切片。脱蜡、复水，将组织样本切片完全覆盖。孵育一抗、二抗，DAB显色，复染、反蓝，再次脱水后封片。40x10倍视野下，每个样本选取3～5个视野进行结果评分。评分标准为：染色强度x染色面积(0～9分)。染色强度：未着色(0分)，轻度染色(1分)，中度染色(2分)，强染色(3分)。阳性染色细胞所占面积：未着色(0分)，<33%的阳性染色细胞(1分)，33～66%的阳性染色细胞(2分)，>66%的阳性染色细胞(3分)。总分≤4分为阴性，﹥4分为阳性。

1.4胃癌细胞AGS培养与转染:使用37℃培养液于血清浓度为10%，青霉素浓度为100U/mL，链霉素为0.1mg/mL，5%CO2环境下常规培养胃癌AGS细胞，胰酶消化，吹打、清洗，种植到六孔板中至细胞生长到对数期时，使用Lipofectamine2000介导细胞转染。分别取250μL无血清无抗生素的培养液稀释5μg shRNA寡聚物和5μL脂质体，轻轻混匀后，将Lipofectamine2000稀释液滴加到稀释的shRNA混合液中，轻轻混匀，室温孵育20min。将混合物(总体积500μL)滴加入培养孔，摇动使其分布均匀，放入培养箱中培养6h后，更换含血清不含抗生素的完全培养液。随后即可进行后续的处理和检测。

1.5CCK8增殖检测:细胞转染培养24h后，细胞密度在70～80%之间。六孔板每孔接种1×106常规培养于CO2培养箱中，每孔加10μL CCK8试剂后，每24h检测一次细胞增殖活力。酶标仪设置450nm波长，检测各孔溶液的吸光度值。

1.6流式细胞术检测细胞凋亡率:取转染培养48h的细胞，加入胰酶消化，离心，PBS洗涤后加入400μL缓冲液，5μL Annexin V-FITC染色液，8℃孵育15min;加10μlPI染色液，8℃孵育15min。流式细胞仪检测转染48h后，细胞的凋亡情况。

1.7Western blot检测细胞相关蛋白的表达:将六孔板置于冰上，加RIPA裂解液(加蛋白酶抑制剂)裂解提取蛋白，BCA法测定浓度，95℃加热5min。TBST溶液清洗膜3次，每次10min。清洗完成后，吸水纸吸干膜表面水分。PVDF膜上滴ECL反应液后，在凝胶成像系统下显影并成像，并用ImageJ软件定量蛋白条带密度，计算各蛋白表达量。

2 结 果

2.1LYN在胃癌与癌旁组织中的表达情况:免疫组织化学分析结果发现，在73例胃癌组织样本中，LYN高表达的样本量为58例，占所有样本量的79.5%。而在同样73例癌旁组织样本中，LYN高表达的样本量仅为28例，占所有样本量的38.4%。两者之间的差异具有统计学意义(P<0.05)，见表1。分析结果表明，与正常的胃上皮组织相比，LYN蛋白水平在胃癌组织中显著高表达。

表1 胃癌组织与癌旁组织中LYN表达差异n(%)

2.2LYN的临床价值:LYN在胃癌组织中的表达与患者的病理分级及分期显著相关(P<0.05)。而与患者的性别、年龄、肿瘤大小等因素无关。见表2。

表2 胃癌患者LYN表达与临床病理参数的相关性研究n(%)

2.3敲低LYN后对AGS细胞的增殖的影响:CCK-8法检测LYN敲低后胃癌细胞的增值情况。研究结果可见sh-LYN转染48h和72h后，转染的AGS细胞在450nm波长下的吸光度值(0.0992±0.0346)和(1.0953±0.0379)，明显低于NC组的(1.4123±0.1161)和(1.6717±0.012)，差异具有统计学意义(P<0.05),见图1。该结果表明，LYN的表达下调显著抑制了AGS细胞的增殖。

2.4敲低LYN的表达后，可以增强AGS细胞的凋亡：流式细胞仪检测LYN表达下调对AGS细胞凋亡的影响。使用荧光素(fluorescein isothiocyanate,FTTC)标记的Annexin V来结合标记早期凋亡的细胞。碘化丙咤(propidium iodide,PI)标记期凋亡中晚细胞。实验结果如图2A显示，LYN敲低后，凋亡细胞的比例显著高于NC对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。我们又利用蛋白印迹分析检测了LYN表达下调对AGS细胞凋亡的影响，如图2B所示，检测结果和流式细胞仪检测结果一致，转染后的AGS细胞的凋亡细胞比例明显增加(P<0.05)。同时我们还利用蛋白印迹分析检测了细胞凋亡相关的关键蛋白的表达，如图2C和2D所示：NC组细胞Bcl2蛋白的相对表达水平为1.000±0.0577，Bax蛋白的相对表达水平为1.000±0.0289，Caspase-9蛋白的相对表达水平为1.000±0.0635，Caspase-3蛋白的相对表达水平为1.000±0.0462；而sh-LYN组细胞Bcl2蛋白的相对表达水平为0.4629±0.0294，Bax蛋白的相对表达水平为1.407±0.0528，Caspase-9蛋白的相对表达水平为1.520±0.1063，Caspase-3蛋白的相对表达水平为1.417±0.0751。相比于NC对照组，sh-LYN敲低LYN的表达之后，Bcl2的表达量下降，而Bax，Caspase-9及Caspase-3表达上升(P<0.05)。

图2 敲低LYN对AGS细胞凋亡的影响

2.5敲低LYN的表达可抑制AKT/mTOR信号通路：蛋白印迹分析调查LYN敲低对AKT/mTOR转导途径中关键蛋白表达的影响。结果如图3所示，NC组细胞p-AKT蛋白的相对表达水平为1.000±0.0578，p-mTOR蛋白的相对表达水平为1.000±0.0693，p70S6K蛋白的相对表达水平为1.000±0.0808；而sh-LYN组细胞p-AKT蛋白的相对表达水平为0.5565±0.0473，p-mTOR蛋白的相对表达水平为0.6167±0.0459，p70S6K蛋白的相对表达水平为0.6049±0.0570。LYN的敲低导致AGS细胞内p-AKT(Ser473)，p-mTOR和p70S6K的表达水平降低，而AKT和mTOR的表达则不受影响。相比于NC对照组，敲低LYN的表达后AGS细胞中p-AKT,p-mTOR以及P70的水平显著降低(P<0.05),而AKT和mTOR的表达没有明显变化。

图3 敲低LYN抑制了AGS细胞内AKT/mTOR信号通路的激活

2.6miR-496对LYN的表达调控：TARGETSCAN软件预测发现miR-496能够结合LYN的3’UTR区域(图4A)。我们之前的研究表明，MiR-496在胃癌细胞中表达下调，且可以抑制胃癌细胞的增殖，诱导胃癌细胞凋亡[2]。本次实验AGS细胞中过表达miR-496后，检测LYN的蛋白表达水平，western blot结果显示转染miR-496后，LYN的蛋白水平明显下降(P<0.05，图4B)，说明miR-496能抑制LYN的表达。

图4 MiR-496抑制胃癌细胞中LYN的表达

3 讨 论

胃癌目前是全球第五大常见肿瘤，发病及死亡率高。围手术期辅助和姑息性化疗的引入提高了局部进展期胃癌的生存率，但是由于肿瘤发展过程中出现的广泛浸润，以及淋巴、远处转移，导致晚期胃癌的治疗仍然很困难[3,4]。LYN的表达非常普遍，但主要是在造血区室中高水平表达，参与细胞内多种信号途径。LYN在实体瘤中的作用最近才得到一些阐明。Adriano的团队在胃癌样本中观察到LYN基因甲基化模式的改变[5]。也就是说，LYN在胃癌中的过度表达可能是因为表观遗传的改变。本研究发现，LYN在胃癌组织中显著高表达,我们的结果也是首次揭露了LYN在胃癌组织中的过度表达而且LYN的过度表达影响着胃癌患者的预后。Zhang等发现LYN敲低的黑色素瘤细胞在培养的第3天和第4天的细胞增值率明显降低[6]。Meng等的研究团队利用转基因前列腺癌小鼠模型(TRAMP)发现LYN对前列腺癌的发生、进展和转移潜能都具有重要意义[7]。但对LYN在胃癌增殖、凋亡中的作用尚不清楚。基于此，本实验中通过shRNA转染AGS细胞，采用CCK-8实验发现敲低LYN的表达后，相比于对照组，LYN敲低组的细胞生存率显著降低，说明敲低LYN的表达能够显著抑制胃癌细胞的增殖。本研究又进一步应用流式细胞术检测敲低胃癌细胞的LYN表达之后细胞凋亡的变化情况，结果显示，降表达LYN能显著促进胃癌细胞凋亡。说明了LYN的表达量与胃癌细胞的增殖及凋亡显著相关。

为了研究降表达LYN诱导细胞增值及凋亡的机制，我们利用蛋白印迹分析，调查了LYN敲低对AKT/mTOR转导途径中关键蛋白表达的影响。PI3K/AKT/mTOR途径是继p53途径之后人类癌症中第二大最常改变的途径，在不同类型的肿瘤中观察到的频率为30%～60%[8]。当PI3K/AKT信号通路活化时AKT的磷酸化水平(p-AKT)提高，p-AKT进一步磷酸化其下游蛋白mTOR,磷酸化的p-mTOR促进其下游蛋白P70的表达，P70可通过促进翻译来促进细胞的增殖、生存等[9]。在本实验中我们发现，敲低LYN的表达后，可使胃癌细胞中p-AKT,p-mTOR以及P70的水平显著降低,而对AKT，mTOR的表达没有显著影响，说明LYN敲低表达可以抑制PI3K/AKT信号通路的磷酸化，从而影响胃癌细胞的增值及凋亡。Bcl-2是抑制凋亡的重要蛋白，Bax则是促凋亡蛋白，Caspase-3和Casapse-9是执行细胞凋亡途径中的关键酶[10,11]。众所周知，内在的凋亡途径受到Bcl-2家族蛋白的严格控制，Bcl-2家族蛋白是线粒体外膜通透性(Mitochondrial outer membrane permeabilization，MOMP)的主要调节剂。有研究显示，抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路可上调肿瘤中Bax、Caspase-9及Caspase-3的蛋白水平，下调Bcl-2的表达[11]。本实验结果显示敲低胃癌细胞中的LYN的表达之后，Bcl-2的表达量下降，而Bax、Caspase-9及Caspase-3的表达量上升，表明LYN表达敲低可以使凋亡蛋白的表达向促进凋亡的方向调控。LYN可以通过对上述蛋白的调节，调控胃癌细胞的凋亡，从而影响细胞的存活。

miRNA在包括肿瘤在内的多种疾病中发挥重要作用，其家族成员miR-496也被发现与多种癌症相关。miR-496在非小细胞肺癌(NSCLC)中异常表达，NSCLC患者细胞系中miR-496的增加均可显著抑制细胞增殖进而调控NSCLC患者的疾病进展[12]。研究表明，miRNA可以通过与靶基因的3'UTR的配对，从而调控靶基因的表达[13]。我们利用TARGETSCAN分析发现miR-496与LYN的3'UTR之间发现了一个结合位点，说明LYN可能是miR-496的潜在靶点。western blot实验对于LYN是miR-496的下游靶点的验证结果显示，上调miR-496 能够显著抑制胃癌细胞中LYN蛋白水平的表达。这提示miR-496可能通过与LYN间的相互抑制，影响胃癌细胞的生长。但是LYN和miR-496在胃癌中的具体作用机制仍需进一步研究。

综上所述，LYN在胃癌组织中异常高表达，敲低其表达可以通过抑制AKT/mTOR信号途径的激活显著抑制胃癌细胞的增殖、并诱导细胞凋亡。同时LYN对胃癌细胞的这些作用受到miR-496的靶向调控。这些研究可能为胃癌的靶向治疗提供新的理论依据。