谢沛璇，姜 岩，安 琪，张中怀，王春仁，张 旭

(黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江大庆 163319)

林蛙(Wood frog)在分类学上属于脊索动物门(Chordata)、脊椎动物亚门(Vertebrata)、两栖纲(Amphibia)、无尾目(Anura)、蛙科(Ranidae)、林蛙属(Rana)。林蛙分布广泛，现已知全世界有林蛙30种左右，我国有17种[1]。林蛙多栖息在林溪中，其生活期可分为水中生活期和森林生活期。由于林蛙具有适应水中和陆地不同环境的能力，使其感染寄生虫的可能性大幅增加[2]。

线虫属于线形动物门(Nemathelminthes)、线虫纲(Nematoda)，绝大多数为自由生活，少部分寄生在人体或动植物体内[3]，其中蛙类是线虫的重要宿主之一。线虫的寄生可导致蛙类的正常发育受阻，影响蛙类的生产性能，而且有些线虫还是人兽共患寄生虫，曾在青蛙体内检出人兽共患的广州管圆线虫[4]，因此在食用或药用蛙时，应特别注意。为了解黑龙江省林蛙肺脏线虫的种类及流行情况，为养殖林蛙寄生虫病的防控提供科学依据，本实验室2019年-2020年在黑龙江省13个地市采集黑龙江林蛙和东北林蛙，对肺部进行解剖镜检，检出的虫体采用形态学观察与分子生物学相结合的方法进行鉴定，并对黑龙江省不同地点不同种蛙的肺脏线虫的感染率和感染强度进行了分析。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物来源 2019年-2020年在黑龙江省13个地市采集黑龙江林蛙778只和东北林蛙174只，共952只。登记后，带回实验室备用。

1.1.2 主要试剂 DNA提取试剂盒、2×TaqPlus PCR Mix、DNA凝胶回收试剂盒均为北京天根生化科技有限公司产品；DNA Marker DL 2 000、pMD18-T载体、大肠埃希氏菌DH5α感受态细胞均为宝生物工程(大连)有限公司产品；其他所用试剂均为国产分析纯试剂。

1.1.3 主要仪器设备 光学显微镜，日本OLYMPUS公司产品；PCR仪，美国Gene Amp PCR System 9700；高速台式离心机，德国Eppendorf公司产品；紫外凝胶成像分析系统，美国Bio-Rad公司产品；电热恒温培养箱，宁波自动化仪表厂产品。

1.2 方法

1.2.1 虫体收集 对样品称重后采用直接剖检法收集两种林蛙的肺部线虫，记录每只蛙体检获的线虫情况。

1.2.2 虫体鉴定

1.2.2.1 形态学鉴定 用光学显微镜对采集的新鲜虫体进行初步形态学观察，对虫体的大小及内部重要器官进行测量，并对口、食道、肠、阴门等部位进行详细观察，参考相关文献进行形态学鉴定[5-6]。

1.2.2.2 分子生物学鉴定 对初步鉴定的虫体按照DNA提取试剂盒操作说明进行基因组DNA的提取。参照文献报道的通用引物[7]：上游引物NC5(5′-GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATT-3′)；下游引物NC2(5′-TTAGTTTCTTTTCCTCCGCT-3′)扩增虫体rDNA-ITS基因部分序列。引物由哈尔滨擎科生物有限公司合成。PCR总反应体系为25 μL，具体如下： 2×TaqPlus PCR Mix 12.5 μL，DNA 模板 1 μL，上、下游引物(10 pmol)各 0.5 μL，ddH2O 10.5 μL，混匀瞬离后进行PCR反应。PCR扩增条件如下：94℃ 5 min；94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min，共35个循环；最后72℃ 7 min。反应结束后，对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察结果并保留图片。PCR产物按照DNA凝胶回收试剂盒的说明书进行纯化。将pMD-18T与纯化产物连接后，转化至大肠埃希氏菌DH5α感受态细胞中培养，筛选阳性菌落，经菌液PCR鉴定后送至哈尔滨擎科生物有限公司进行测序。

1.2.2.3 序列和进化分析 对扩增获得目的基因与GenBank公布的相关序列进行Blast同源性分析。应用MEGA 6.0软件对序列进行分析，同时采取最大简约法构建进化树，探讨所获得虫体与其他线虫的亲缘关系。

1.2.3 感染情况调查 在形态学鉴定的基础上，计算蛙类肺脏线虫的感染率和平均感染强度。感染率(%)=(肺线虫感染阳性数÷被检测林蛙总只数)×100%；平均感染强度(条/只)=肺线虫检出总数÷肺线虫感染阳性林蛙只数。

1.2.4 统计分析 使用Excel软件对数据进行汇总整理，应用SPSS软件对不同地点、不同种林蛙的感染情况进行统计分析。

2 结果

2.1 虫体鉴定

2.1.1 形态学鉴定 在显微镜下仔细对从肺部检出的线虫进行详细观察，发现所有虫体的大小、外部形态和内容结构均相似，初步认定为一种虫体。虫体细长，口有6片不明显的唇，口囊小且短宽；食道短钝，后部明显膨大，神经环位于食道前部。肠呈黑色，宽而直；尾部基部宽大，尾端尖细；阴门位于体中(图1)。虫卵呈椭圆形，产出时卵内已有幼虫。线虫的各个器官的测量数值见表1。根据形态和测量数据，初步鉴定该肺脏线虫为蟾蜍棒线虫(Rhabdiasbufonis)。

a.虫体整体观；b.虫体头端；c.虫体中部；d.虫体尾端

2.1.2 分子生物学鉴定 成功扩增该虫体的ITS序列，琼脂糖凝胶电泳分析，约700 bp处有明显条带，条带大小在预期目的片段范围之内(图2)。测序结果显示本研究的虫体ITS基因序列长度为711 bp。经过Blast比对分析发现该虫体序列与GenBank上已发表的蟾蜍棒线虫(KF999593)的ITS序列的相似性为99.43%。

M.DNA标准DL 2 000；1.虫体ITS序列产物M.DNA Marker DL 2 000; 1.ITS products of the lungworm

2.1.3 进化分析 以日本丽尾线虫(Cosmocercajaponica，LC052772)为外群，13种线虫构建进化树见图3。所有线虫分为两大支，Serpentirhabdias属线虫为一支，而Rhabdias属和Entomelas属线虫形成另一支。本实验虫体与Rhabdias属其他肺线虫聚集在一起，形成一个小的分支，并且与蟾蜍棒线虫(Rhabdiasbufonis，KF999593)聚集在一起。因此，结合形态学和分子生物学结果，鉴定该虫体为蟾蜍棒线虫。

2.2 黑龙江省林蛙肺线虫感染情况

2.2.1 黑龙江省不同种类林蛙肺线虫感染情况 在剖检的952只林蛙中共检出肺线虫11 646条。阳性蛙866只，感染率为90.97%，平均感染强度为13.45条(表2)。由此可见，黑龙江省东北林蛙和黑龙江林蛙肺脏线虫感染率和感染强度都较高。两种林蛙之间感染率差异不显著(P>0.05)。

2.2.2 黑龙江省不同地点林蛙肺脏线虫感染情况 黑龙江省林蛙肺线虫感染非常广泛，不同地点林蛙体内均检出了大量虫体(表3)。统计结果显示，黑龙江地区感染率最高的是绥化(98.29%)，最低的为伊春(80.95%)；感染强度最大的为大庆(93条)。不同地点2种林蛙的感染率和感染强度差异均不显著(P>0.05)。

表1线虫的测量结果(单位：mm)

图3基于ITS序列的进化分析

表2黑龙江省两种林蛙肺脏线虫感染情况

3 讨论

寄生虫的分类鉴定是寄生虫研究的基础，准确的鉴定寄生虫种类对预防和控制寄生虫病有重大的意义[11]。长期以来，动物寄生虫鉴定主要以形态学鉴定方法为主。由于寄生虫形态学特征易受地理环境的影响，且要求研究人员必须具有一定的理论知识和丰富的鉴定经验，对寄生虫鉴定有一定的局限性。由于棒线虫属中各种线虫形态非常相似，为了准确鉴定，我们在形态学鉴定的基础上结合了分子生物学方法。

表3黑龙江省不同地市林蛙肺脏线虫感染率和感染强度

自20世纪80年代以来，分子生物学技术迅猛发展，尤其是PCR技术的快速发展，为寄生虫的鉴定开辟了全新的道路[12]。rDNA-ITS即核糖体内转录间隔区，因其PCR扩增效率和测序成功率较好，还具有种内变异小而种间变异大的特性，因而被作为种类鉴定和系统发育分析的一种重要的分子标记，被广泛应用于寄生虫鉴定、亲缘关系以及系统发育等方面的研究[13-16]。

本试验检获的虫体，在形态上完全一致，形态学初步鉴定为蟾蜍棒线虫。虫体的ITS序列与GenBank已发表的蟾蜍棒线虫(KF999593)的相似性达到了99.43%，进化分析显示，本实验虫体与蟾蜍棒线虫处于同一分支中，因此结合形态学观察以及分子生物学结果，鉴定此线虫为蟾蜍棒线虫。

棒线属线虫种类繁多，主要寄生于两栖爬行动物的肺脏内，全世界有30余种。国内报道的蛙类棒线虫有5种，分别为蟾蜍棒线虫(Rhabdiasbufonis)、日本棒线虫(Rhabdiasnipponica)、球头棒线虫(Rhabdiasglobocephala)、双冠棒线虫(Rhabdiasbicornis)和蜥蜴棒线虫(Rhabdiasincerta)。本研究检出的蟾蜍棒线虫与李卓等[17]在长白山林区中国林蛙肺中检出的双角棒线虫(Rhabdiasbufonis)为同物异名。

感染情况调查结果显示，黑龙江地区林蛙肺线虫的感染率高(90.97%)，感染强度大(13.45条)，感染率明显高于已有报道[18-19]。本结果显示东北林蛙和黑龙江林蛙肺脏线虫的感染率和感染强度无显著差异，不同地点2种林蛙的感染率和感染强度差异均不显著(P>0.05)，这可能与黑龙江省的蛙类生活环境相似有关。

林蛙作为蛤蟆油的基源动物，具有很高的经济价值，其市场需求大，黑龙江省在林蛙养殖业发展有着天然优势[20]。在剖检过程中发现肺脏组织充血肿胀，有大量线虫堆积堵塞气管的情况。因此认为，林蛙肺脏线虫可严重危害林蛙的生长发育，严重甚至可导致个体死亡，这会为养殖户造成严重的经济损失。本研究对黑龙江省的黑龙江林蛙和东北林蛙的肺脏寄生线虫的种类进行鉴定，并对其感染率和感染强度进行了调查，为黑龙江省养殖林蛙肺线虫病防控提供了科学依据。