李晨依，喻奇伟，罗贞宝，朱紫童，康 俊，贾宏昉*

（1河南农业大学烟草学院，河南郑州 450002；2贵州省烟草公司毕节市公司，贵州毕节 551700）

0 引言

【研究意义】烟草（L.）是一种喜钾经济作物，其生长发育和品质形成与钾元素密切相关，但我国大部分烟叶钾含量仅1.5%左右（罗华元等，2010），远低于优质烟叶钾含量的最低标准（2%）（杨铁钊等，2002）。因此，提高烟叶钾含量是我国烟草产业发展亟待解决的问题。植物高亲和钾转运蛋白（High affinity kalium transporter，HAK）属于K转运载体KUP/HAK/KT家族蛋白，该家族成员主要参与低钾条件下植物对K的吸收与转运，还可通过调节植物体内Na/K平衡来提高植物抗逆性（王北辰和伍国强，2021）。因此，克隆烟草基因并分析其在不同胁迫下的表达模式，以期揭示该基因在烟草抵御低钾胁迫等非生物胁迫中的功能和作用机制，对培育K高效吸收优质烟草新品种具有重要意义。【前人研究进展】植物吸收利用K主要是通过K通道蛋白和K转运蛋白来完成（Wang and Wu，2013）。根据K转运蛋白的序列和结构特征，K转运蛋白可分为四大家族，分别为KUP/HAK/KT家族、HKT/Trk/Ktr家族、CHX家族和KEA家族（He et al.，2012；Song et al.，2019）。其中，KUP/HAK/KT家族最大，成员最多，分布最广（Ahn et al.，2004）。目前已在大麦（Santa-María et al.，1997）、拟南芥（He et al.，2012）、玉米（Nieves-Cordones et al.，2016）、水稻（Chen et al.，2015）和谷子（Zhang et al.，2018）中鉴定出多个KUP/HAK/KT家族基因。研究发现，大麦和基因均受低钾胁迫诱导表达量明显升高，其中过表达基因可显著增加叶片钾含量（Boscari et al.，2009）；拟南芥基因受低钾胁迫诱导表达量明显升高（Rubio et al.，2014）；水稻中过表达基因能显著提高转基因水稻K的转运效率（Chen et al.，2015），且基因参与调控K从根部向地上部的转运，在维持水稻Na/K平衡方面发挥关键作用（Feng et al.，2019）；谷子基因受低钾诱导表达量明显升高，有效促进植株对K的吸收利用，而基因对低钾胁迫不敏感，主要参与正常供钾条件下K的吸收（Zhang et al.，2018）；玉米的2个高亲和钾转运蛋白ZmHAK1和ZmHAK5均参与调控K的转运，且ZmHAK5转运能力强于ZmHAK1（Qin et al，2019）。有关烟草基因研究发现，普通烟草可能有41个基 因 家 族 成 员，仅 有、、和等少数基因被克隆鉴定，初步证实基因不响应低钾胁迫（鲁黎明和杨铁钊，2011），但可通过协调Na/K平衡提高烟株抗逆性（秦利君等，2015；张祎等，2017）；、和基因在烟草幼苗根系中表达，且在低钾胁迫下表达量升高（Song et al.，2019）。【本研究切入点】虽然已证实家族基因在植物K吸收和转运过程中发挥重要作用，但目前有关烟草基因的研究报道较少，尚未见有关烟草基因克隆及其在不同胁迫下表达模式分析的研究报道。【拟解决的关键问题】基于烟草基因组和转录组测序数据，克隆基因，并对其生物学信息、亚细胞定位和表达模式进行分析，进而揭示基因在烟草抵御低钾胁迫及其他非生物胁迫的作用，为探究烟草在非生物胁迫下对K的吸收和转运机制提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试的烟草品种为普通烤烟品种K326。Eastep Super Total RNA Extraction Kit试剂盒购自上海普洛麦格生物产品有限公司；HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit（+gDNA wiper）试剂盒、Pro Universal SYBR qPCR Master Mix试剂盒以及大肠杆菌DH5α感受态细胞购自南京诺唯赞生物技术有限公司。主要仪器设备：光照培养箱（RXZ-1000，中国宁波江南仪器厂）、PCR仪（Analytikjena，德国）、Fluo View FV1000 激光共聚焦显微镜（Olympus，日本）。

1.2 样品培养及胁迫处理

将烟草种子放入霍格兰营养液后置于培养箱［光/暗周期为16 h/8 h，温度为28 ℃/22 ℃，光强度为300 μmol/（m·s），相对湿度60%］中培养，待种子露白后，先使用1/4霍格兰营养液培养3 d，再使用1/2霍格兰营养液培养3 d，最后使用霍格兰营养液培养4 d后，对幼苗进行非生物胁迫处理（尹卓然等，2022），包括低钾胁迫处理（0.1 mmol/L K）、干旱胁迫处理（10% PEG-6000）、盐胁迫处理（150 mmol/L NaCl）、低氮胁迫处理（0.25 mmol/L NO）、低磷胁迫处理（0.1 mmol/L PO）和冷害胁迫处理（4 ℃），以未胁迫处理（正常供钾2 mmol/L K）的植株样品为对照（CK）。其中，冷害胁迫处理3 h后整株取样，其余胁迫处理7 d后整株取样，用于检测不同胁迫下基因的表达情况。

用霍格兰营养液培养烟苗21 d后进行低钾（0.1 mmol/L K）胁迫处理7 d，然后取根、茎、新叶（从上往下数完全展开的第2片叶）和老叶（从上往下数第7片叶），用于检测基因在烟草不同组织的表达模式。以正常供钾（2 mmol/L K）的植株组织为对照（CK）。

1.3 目的基因克隆

从NCBI数据库搜索获取基因的参考序列（GenBank登录号XM_016628407.1），利用Primer Premier 6设计基因编码区（CDS）序列的特异扩增引物，以低钾胁迫处理的烟草叶片cDNA为模板进行PCR扩增。反应体系（50 μL）：5×PCR Buffer 10 μL，100 ng/μL cDNA 模 板2 μL，Primer Star DNA聚合酶1 μL，10 μmol/L上、下游引物2 μL；2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，ddHO补足至50 μL。扩增程序：94 ℃5 min；94 ℃30 s，58 ℃30 s，72 ℃2.5 min，进行35个循环，72 ℃延伸5 min。利用DNA连接酶将扩增获得的目的片段和pMD19-T载体连接，送武汉伯远生物科技有限公司进行测序，从而获得目的基因序列信息。

1.4 生物信息学分析

利用NCBI数据库的ORFfinder将基因序列翻译成氨基酸序列；利用NetPhos 2.0 Serve预测NtHAK5的磷酸化位点；利用DNAMAN 9.0将NtHAK5蛋白与烟草、拟南芥、玉米和水稻的HAK家族蛋白进行氨基酸序列分析；利用ExPASy网站的ProtParam和SWISS-MODEL分析蛋白的理化性质和结构；使用TMPRED预测NtHAK5蛋白的跨膜结构域（黄化刚等，2016）。

1.5 启动子顺式作用元件分析

以基因CDS序列作为探针，利用Sol Genomics Network中的Blast程序查询该基因序列全长，并利用PlantCARE网站对其起始密码子上游2000 bp序列进行启动子顺式作用元件分析（曾露桂等，2020）。

1.6 亚细胞定位分析

参考尹卓然等（2022）的方法构建植物表达载体pBWA（V）HS--GLosgfp，通过农杆菌介导转染烟草表皮细胞，然后置于培养箱（温度22 ℃）中培养30～60 h。通过激光共聚焦显微镜观察细胞中荧光蛋白的位置。以不含基因序列的pBWA（V）HS-GLosgfp空载体为对照。

1.7 基因表达分析

参照Pro Universal SYBR qPCR Master Mix试剂盒说明进行实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测，选择烟草核糖体蛋白编码基因（）（GenBank登录号L18908.1）作为内参基因，设3次重复。采用2算法计算目的基因的相对表达量（黄化刚等，2016），并利用DPS7.0和Origin 2018进行数据分析及作图。

2 结果与分析

2.1 NtHAK5基因的PCR扩增结果

以普通烟草K326的叶片cDNA作为模板扩增基因全长CDS序列，结果（图1）显示，扩增条带长度约为2500 bp。将其测序结果与基因参考序列（XM_016628407.1）进行比对，结果显示，两者的核苷酸序列相似性达100%，表明克隆获得的序列为基因CDS序列，长度为2418 bp，编码805个氨基酸残基。

2.2 NtHAK5蛋白的理化性性质及结构域预测结果

NtHAK5蛋白由805个氨基酸组成，分子式为CHNOS，分子量为89874.00 Da，理论等电点（pI）为8.65，含有70个酸性氨基酸和77个碱性氨基酸；不稳定性指数（Ⅱ）为33.70，属于稳定蛋白。该蛋白的二级结构中α-螺旋占40.12%，延伸链占24.97%，无规则卷曲占26.21%，β-折叠占8.70%。NtHAK5蛋白包含45个丝氨酸、19个苏氨酸和11个酪氨酸，推测磷酸化可能发生在以上位点，且其包含12个疏水跨膜区，第二和第三区域间存在1个带电荷中央亲水环，并将其分成2组，具有典型的植物HAK家族跨膜结构域（图2）。

2.3 NtHAK5蛋白的氨基酸序列比对及系统发育分析结果

NtHAK5与烟草NtHAK1和黄花烟草NrHAK1蛋白的氨基酸相似性分别为40.69%和40.44%，与拟南芥AtHAK5、玉米ZmHAK5和水稻OsHAK1蛋白的氨基酸相似性为58.26%、56.24%和52.47%（图3）。根据氨基酸序列的相似性构建系统发育进化树，结果（图4）显示NtHAK5蛋白与AtHAK5蛋白聚在一个分支，推测烟草NtHAK5蛋白具有与拟南芥AtHAK5蛋白相似的功能，故推测NtHAK5蛋白介导高亲和性K吸收并参与调控烟草K转运过程。

2.4 NtHAK5基因启动子顺式作用元件分析结果

由图5可知，在基因启动子中包含2个参与厌氧诱导响应的顺式作用元件（ARE）；2个与脱落酸（ABA）响应相关的顺式作用元件（ABRE），其能与转录因子有效结合，从而促进或抑制ABA诱导基因的表达，致使植株衰老速度加快或减缓；1个参与低温响应的顺式作用元件（LTR），1个参与干旱响应的顺式作用元件（MBS），可分别增强植物的抗寒和抗干旱能力；1个参与防御和应激响应的顺式作用元件（TC-rich repeats）；2个参与茉莉酸甲酯（MeJA）响应的顺式作用元件（CGTCA-motif和TGACG-motif），其能响应植物损伤，外源使用MeJA可诱导防御基因表达，从而激发植物的化学防御，推测基因在逆境胁迫响应和延缓植物衰老过程中发挥作用。

2.5 NtHAK5蛋白的亚细胞定位结果

将构建的植物表达载体pBWA（V）HS--GLosgfp通过农杆菌介导转染烟草表皮细胞后，利用荧光共聚焦显微镜观察侵染后的叶片，结果（图6）发现叶片细胞的细胞膜中有荧光信号，表明NtHAK5蛋白定位于烟草叶片的细胞膜上。

2.6 低钾胁迫下NtHAK5基因的组织表达特性分析

利用qRT-PCR检测低钾胁迫处理（0.1 mmol/L K）下不同组织基因的相对表达量，以正常供钾（2 mmol/L K）的植株组织为对照（CK），结果如图7所示。低钾胁迫处理下和正常供钾（CK）条件下，基因在烟草根、茎、老叶和新叶中均有表达，且均以老叶中相对表达量最高，表明基因主要在叶片尤其是老叶中高表达，具有明显组织表达特异性。在低钾胁迫处理下，烟草根、茎、老叶和新叶中基因的相对表达量均显著高于CK（＜0.05，下同），说明基因受低钾胁迫诱导过表达，可能参与烟草抵御低钾胁迫的过程，属于典型的家族基因，不仅参与K的吸收，还参与了烟草叶片中K再利用过程。

2.7 非生物胁迫下NtHAK5基因的表达特性分析

为了研究基因对非生物胁迫的响应，以无胁迫处理（正常供钾2 mmol/L K）的植株为对照（CK），通过qRT-PCR 检测不同非生物胁迫下的基因的表达情况，结果如图8所示，基因在干旱胁迫、冷害胁迫、盐胁迫和低钾胁迫下的相对表达量显著高于CK，但在低氮胁迫和低磷胁迫下的相对表达量与CK无显著差异（＞0.05），说明基因参与烟草植株对干旱胁迫、冷害胁迫、盐胁迫和低钾胁迫的响应。

3 讨论

家族基因已在多种植物中被克隆和鉴定，其主要参与植物对K的吸收、转运与再利用，且大部分基因受低钾胁迫信号的调控（苏文等，2020）。本研究对基因进行克隆及生物信息学分析，结果表明基因编码蛋白共有12个疏水跨膜区，第二和第三区域间存在1个带电荷中央亲水环，与已报道的HAK蛋白结构高度相似（Véry and Sentenac，2003），证明NtHAK5蛋白具有HAK家族成员特征。氨基酸序列对比结果显示，NtHAK5蛋白与拟南芥AtHAK5蛋白的氨基酸序列相似性最高。将NtHAK5与其他植物的HAK蛋白进行系统发育分析，结果表明NtHAK5与拟南芥AtHAK5聚在一个分支，证明两者亲缘关系最近，基因具有基因相似的生物学功能。由于AtHAK5是拟南芥中重要的高亲和钾转运蛋白（Ahn et al.，2004），故推测NtHAK5蛋白在烟草K吸收转运过程中发挥重要作用。启动子的顺式作用元件能调控基因的表达模式（Saeed et al.，2006），且与多种胁迫响应密切相关（Walther et al.，2007）。本研究发现基因启动子不仅包含多个参与防御、低温响应、应激反应和干旱诱导等顺式作用元件，还含有响应ABA诱导的核心元件ABRE，由于ABA在植物响应逆境胁迫中发挥重要调节作用（张彦桃等，2014），因此，推测受ABA信号的调控参与各种非生物胁迫。本研究亚细胞定位结果显示，NtHAK5蛋白主要定位于细胞膜，与其他植物HAK家族蛋白的亚细胞定位一致，如水稻中的OsHAK1、OsHAK2和OsHAK5蛋白定位于细胞膜（柴薇薇等，2019）。由于植物蛋白质的亚细胞定位结果暗示其功能特性，故推测NtHAK5蛋白通过细胞膜参与烟草植株的K吸收与转运。综上所述，初步推测NtHAK5是具有吸收和转运K功能的膜蛋白，并参与多种非生物胁迫过程。

本研究对基因在烟草不同组织中的表达水平进行分析，结果发现基因在根、茎和叶中均有表达，尤其在老叶中相对表达量最高，可能该基因通过调控老叶中K的再利用参与烟草生长发育过程，表明基因具有组织特异性。本研究进一步分析了基因在烟草非生物胁迫下的表达模式，并结合启动子顺式作用元件分析结果，推测基因参与了非生物逆境胁迫（低钾、干旱、高盐和冷害）下K的吸收和再利用过程，尤其是通过调控老叶中K的再利用从而提高烟草的钾素利用效率。转录调控在植物体内普遍存在，主要用于响应外界环境刺激。目前已有大量研究证明，K转运体基因主要在转录水平受到调节，如拟南芥中的转录因子ARF2和RAP2.11可直接结合到基因启动子上，从而调节该基因转录水平，区别在于ARF2是基因的负向调控因子，并在低钾条件下发生磷酸化，从而解除对基因的转录抑制（赵帅，2016），而RAP2.11正向调节基因的转录水平，从而响应低钾胁迫（王欣等，2013）。此外，植物响应低钾胁迫还受Ca、活性氧（ROS）和茉莉酸等信号物质的影响，推测低钾胁迫下基因表达可能受以上或其他转录因子及信号物质调控，且调控机制尚待研究。目前拟南芥、水稻等模式植物中多个基因已被证实可响应低钾胁迫、高盐胁迫和干旱胁迫等，例如、和基因在盐胁迫下表达上调，通过维持水稻中的Na/K平衡从而增强水稻的耐盐性（Yang et al.，2014；Chen et al.，2015；Shen et al.，2015）；拟南芥、和基因参与调控拟南芥的耐盐反应（Aleman et al.，2014）；拟南芥基因通过正向调节钾含量促进植物响应干旱和渗透胁迫（Brauer et al.，2016）；在烟草中过表达基因可提高转基因烟草的耐旱性等（张祎等，2017）。因此，今后可通过转基因技术深入解析基因在烟草K吸收与再利用过程中的生物学功能。

4 结论

属于基因家族成员，具有明显组织表达特异性，参与烟草植株对干旱胁迫、冷害胁迫、盐胁迫和低钾胁迫等非生物胁迫响应，推测其编码的蛋白在烟草组织中作为K转运体参与非生物胁迫下K的吸收、转运和再利用。