吉思璇， 吴 迪， 白曼莫

动脉瘤性蛛网膜下腔出血（aneurysmal subarachnoid hemorrhage，aSAH） 是颅内动脉瘤破裂引发的一种脑出血性疾病，致残率和致死率均较高［1-2］。 据报道，aSAH 患者接受及时治疗后1 年内病死率高达50%，远期病死率仍高达10%～24%［3-5］。 探究可评估aSAH 预后的指标有着重要意义， 可辅助临床治疗方案的制定。 瞬时受体电位通道M2（transient receptor potential melastatin 2，TRPM2） 是瞬时受体电位蛋白超家族中一员，作为一种重要的离子通道介导多种细胞反应，如通过其钙离子可调节过氧化氢诱导的细胞死亡，还会促进单核细胞和巨噬细胞分泌趋化因子，加剧炎症反应［6］。Pan 等［7］研究表明，干扰TRPM2 表达可降低氧化应激损伤、 细胞内钙离子浓度及核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白（NLRP）3 炎性小体激活，从而抑制葡萄糖剥夺诱导的神经元细胞凋亡。 基于上述研究， 有理由认为TRPM2 参与了aSAH 进展过程，是其预后评估的潜在生物标志物。 目前鲜有研究分析TRPM2 与aSAH预后的关系， 本研究选取接受介入治疗的aSAH 患者作为研究对象， 分析TRPM2 与aSAH 预后的关系，以期为aSAH 预后评估提供参考。

1 材料与方法

1.1 研究对象

选取2019 年8 月至2021 年5 月在三亚市中医院参照《中国蛛网膜下腔出血诊治指南2019》［8］、经血管造影确诊并接受介入治疗的aSAH 患者作为研究对象。纳入标准：①首次发病，且在发病12 h 内接受支架联合弹簧圈动脉瘤栓塞术治疗； ②年龄≤70 岁；③随访资料完整；④签署手术知情同意书。 排除标准：①非动脉瘤破裂诱发的脑出血；②有冠心病史、脑卒中史、神经退行性疾病史、下肢动脉硬化闭塞症史或恶性肿瘤史等；③心肝肾功能异常；④生命体征不稳定； ⑤国际标准化比值＞1.4 或血小板计数＜100×109/L。 本研究符合《赫尔辛基宣言》，已获医学伦理委员会批准（2021-006）。

1.2 介入治疗

手术在全身麻醉下进行，采用Seldinger 技术穿刺股动脉，置入6 F 导管，全身肝素化， DSA 造影测量动脉瘤大小，选择适宜支架；将支架导管置入距动脉瘤远端1 cm 处，Echolon 导管送至动脉瘤体1/2 处，释放弹簧圈，同时半释放支架覆盖动脉瘤颈至弹簧圈填塞致密后退出导管， 完全释放支架［9］；即刻造影确定栓塞程度、支架位置等。 若术中出现脑血管痉挛给予静脉注射用盐酸罂粟碱（30～120 mg/次，山东北大高科华泰制药公司，国药准字H20052331）处理。

1.3 外周血中单个核细胞提取

用Ficoll 密度梯度离心法分离外周血中单个核细胞，操作如下：分别于介入治疗前和治疗24 h内抽取aSAH 患者空腹肘部静脉血10 mL，用磷酸盐缓冲溶液进行稀释，并将稀释液滴入Ficoll 分离液中，4℃2 000 r/min 离心20 min，吸取单个核细胞层细胞； 再次用磷酸盐缓冲溶液稀释细胞，4℃1 500 r/min 离心10 min，吸取细胞，重复该操作2 次［10］。

1.4 TRPM2 水平检测

用蛋白质免疫印迹法检测TRPM2 水平， 操作如下：用含放射免疫沉淀试验（RIPA）溶液裂解细胞，离心后提取蛋白，二辛可酸（BCA）试剂盒定量；凝胶电泳（电压80～120 V）至溴酚蓝跑出胶面，漂洗、 转膜后用脱脂奶粉室温封闭2 h； 一抗兔抗人TRPM2 多克隆抗体和兔抗人3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）多克隆抗体（武汉益普生物科技公司）4℃孵育过夜，二抗山羊抗兔IgG 多克隆抗体（武汉菲恩生物科技公司）室温孵育2 h；电化学发光（ECL）液显影，Image J 1.8.0 软件读取蛋白质免疫印迹图像［11］。计算TRPM2 相对内参GAPDH 的表达水平。

1.5 预后随访和评价

采用门诊和电话方式随访，评估aSAH 患者治疗90 d 后改良Rankin 量表（mRS）评分。 本研究随访截止时间为2021 年9 月5 日。 mRS 评分≤2 分为预后良好，＞2 分为预后不良［12］。

1.6 统计学方法

采用4.1.0 版R 软件进行统计学分析。 正态分布的计量资料以均数±标准差表示，两组间比较用独立样本t 检验， 组内治疗前后比较用配对样本t 检验；非正态分布的计量资料以M（P25，P75）表示，两组间比较用Mann-Whitney U 检验。 计数资料用例和率（%）表示，组间比较用χ2检验。 采用受试者工作特征曲线 （receiver operating characteristic curve，ROC）评价TRPM2 判断aSAH 预后的价值，logisti回归分析影响aSAH 预后的因素。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

符合纳入标准的aSAH 患者共165 例， 术后获随访148 例，随访率为89.7%。 148 例中男57 例，女91 例； 年龄范围40～64 岁， 中位年龄46（45，49）岁；体质量指数（BMI）为（25.45±2.36） kg/m2；有高血压史71 例，高脂血症史55 例，糖尿病史33 例；动脉瘤位于前循环67 例，后循环34 例，前后循环47例；Hunt-Hess 分级Ⅰ、 Ⅱ级86 例， Ⅲ级62 例；Fisher 分级Ⅰ、Ⅱ级139 例，Ⅲ级9 例；脑血管痉挛29 例；Glasgow 昏迷量表（GCS）评分为6（4，7）分。随访结束后，mRS 评分≤2 分107 例（预后良好组），＞2 分41 例（预后不良组）。

两组间性别构成、BMI、高血压史占比、糖尿病史占比、高脂血症史占比、动脉瘤位置构成和Fisher分级构成差异无统计学意义（均P＞0.05），预后良好组年龄、Hunt-Hess 分级Ⅲ级占比、脑血管痉挛占比和GCS 评分均低于预后不良组，差异有统计学意义（均P＜0.05），见表1。

表1 两组基线资料比较

预后良好组治疗前后TRPM2 水平分别为（0.45±0.09） g/L、（0.25±0.05） g/L， 均低于预后不良组（0.51±0.13） g/L、（0.34±0.06） g/L，差异均有统计学意义（t=2.645，P=0.011；t=7.768，P＜0.01）。预后良好组、 预后不良组治疗后TRPM2 水平均低于治疗前，差异均有统计学意义（t=20.208、9.806，均P＜0.01）； 治疗前后TRPM2 水平变化值分别为0.19（0.12，0.27）和0.13（0.08，0.27），差异无统计学意义（Z=1.652，P=0.098）。 见图1。

图1 aSAH 患者治疗前后TRPM2 水平

治疗前TRPM2 判断aSAH 患者预后的ROC 曲线下面积（AUC）、最佳截断点、灵敏度和特异度分别为0.622（95%CI：0.511～0.734）、0.55、41.46%和87.85%，治疗后TRPM2 判断aSAH 患者预后的AUC、最佳截断点、灵敏度和特异度分别为0.885（95%CI：0.822～0.947）、0.28、82.93%和80.37%，治疗后TRPM2 判断aSAH 患者预后的AUC 高于治疗前TRPM2，差异有统计学意义（Z=4.672，P＜0.01）。

将aSAH 患者预后作为因变量， 年龄、GCS 评分、 治疗后TRPM2、Hunt-Hess 分级、Fisher 分级和脑血管痉挛作为自变量纳入线性回归分析（变量赋值见表2），结果显示上述因素的容忍度均大于0.1，方差膨胀因子均小于10，见表3；提示上述因素不存在共线性。将上述因素纳入多因素logistic 回归分析，结果显示GCS 评分高、治疗后TRPM2＞0.28 和Hunt-Hess 分级Ⅲ级是aSAH 患者预后的独立危险因素（P＜0.05），见表4。

表2 变量赋值

表3 各变量共线性检验结果

表4 logistic 分析aSAH 患者预后风险因素

3 讨论

准确评估aSAH 预后具有重要意义， 有助于制定患者后续治疗方案。 目前临床主要应用Hunt-Hess分级评价aSAH 患者预后［13］，但该分级各等级间划分标准的界限不清晰，受主观因素影响较大［14-15］，因此亟需探究评价aSAH 患者预后的新指标。 TRPM2是一种非选择性钙离子可渗透的阳离子通道，在机体内广泛分布，对氧化应激的激活高度敏感［16］。 氧化应激损伤一般多通过破坏细胞内离子稳态诱导细胞死亡。 多数研究表明TRPM2 在介导氧化应激诱导的细胞死亡过程中发挥着重要作用，包括脑缺血-再灌注损伤、β-淀粉样蛋白寡聚体相关神经毒性和记忆障碍、 神经毒素1-甲基-4-苯基吡啶离子/1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶诱导的细胞死亡和破坏血管内皮功能［17-20］等。

本研究结果显示，预后良好组治疗前后TRPM2水平均低于预后不良组，提示TRPM2 与aSAH 患者预后有关，是评估其预后的潜在生物标志物；结果还显示预后良好组和预后不良组治疗后的TRPM2水平均低于治疗前， 提示介入治疗会影响aSAH 患者TRPM2 水平，但其具体原因仍需研究探明。 本研究用AUC 评价TRPM2 判断aSAH 患者预后的价值，结果显示治疗后TRPM2 判断aSAH 患者预后的AUC、 灵敏度和特异度分别为0.885、82.93%和80.37%， 治疗后TRPM2 判断aSAH 患者预后的AUC 高于治疗前TRPM2，表明治疗后TRPM2 判断aSAH 患者预后有一定价值，可辅助临床决策。

既往有研究表明，TRPM2 与炎性反应、 氧化应激及调节细胞内钙离子浓度等有关，并通过上述机制参与神经元凋亡［6-7］。 本研究中多因素logistic 回归分析结果显示，治疗后TRPM2＞0.28 是aSAH 患者预后的独立危险因素， 推测其原因是治疗后TRPM2 水平与神经元凋亡、脑部炎症和氧化应激损伤、细胞内钙离子浓度及NLRP3 炎性小体激活等有关， 上述因素均与神经元的功能和生存状态有关，因此可反映患者预后；研究结果还显示GCS 评分高和Hunt-Hess Ⅲ级是aSAH 患者预后的独立危险因素，这与既往研究［21-22］报道一致。 张鹏等［23］研究表明， 脑血管痉挛和Fisher 分级与aSAH 患者预后不良有关。 本研究结果显示脑血管痉挛并非aSAH 患者预后的独立危险因素，推测其原因与研究样本量大小有关，还需开展大样本研究予以验证。

综上所述，aSAH 患者介入治疗后TRPM2 水平高与预后不良有关。本研究尚存在一定不足，如仅分析治疗前后两个时间点的TRPM2 水平与aSAH 患者预后的关系， 后续将增加时间梯度，进一步探究； 此外， 对于接受外科手术治疗后患者TRPM2 是否可用于预后评估及其临床价值，还需进一步研究。