王嘉菲, 田 洲, 王 蕾, 陈 娟

(北京市大兴区人民医院 消化内科, 北京, 102699)

胃溃疡是世界范围内常见的一种消化系统疾病，主要由感染幽门螺杆菌(Hp)、分泌大量胃酸、服用大量非甾体消炎药造成，此外不良生活习惯也会导致胃溃疡的发生，严重时良性胃溃疡还会向恶性胃溃疡转变[1]。部分胃溃疡会发生癌变，而尽早治疗可减少癌变的发生，对保障患者的生命健康极为重要[2]。颗粒蛋白前体(PGRN)是分泌型生长因子的上皮蛋白家族成员之一，在肿瘤发生、胚胎发育、炎症调节、伤口愈合中起重要作用[3]。研究[4]表明, PGRN高表达与癌症扩散的发生相关。E-钙黏附蛋白(E-cadherin)是一种跨膜糖蛋白，属于钙黏蛋白家族成员之一，钙黏蛋白间的相互作用可确保细胞间紧密接触，已有研究[5-6]发现胃癌的发生一定程度上与上皮钙黏蛋白的表达异常有关。既往关于PGRN、E-Cadherin的研究多集中于子宫颈鳞癌、卵巢癌、结直肠癌等方面，目前关于良恶性胃溃疡中PGRN、E-Cadherin的研究较少。本研究探讨了PGRN、E-Cadherin在良恶性胃溃疡组织中的表达及临床意义，以期为探究PGRN、E-Cadherin在胃溃疡中的作用机制提供一定的理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2015年4月—2017年7月北京市大兴区人民医院收治的190例胃溃疡患者作为研究对象。将85例良性胃溃疡患者纳入良性胃溃疡组，男40例，女45例，平均年龄(50.32±15.31)岁，取其胃镜活检组织作为样本; 将105例恶性胃溃疡(溃疡型胃癌)患者纳入溃疡型胃癌组，男54例，女51例，平均年龄(52.33±16.85)岁，取其手术切除溃疡型胃癌组织作为样本。纳入标准: ① 经镜检、活检确诊，临床资料完整者; ② 首次患病，无Hp根除治疗史者; ③ 未接受其他方法治疗者; ④ 溃疡型胃癌患者均接受手术切除治疗。排除标准: 患有自身免疫系统疾病者。本研究经北京市大兴区人民医院医学伦理委员会审核批准，所有患者和家属知情并签署同意书。

1.2 主要材料

兔抗人PGRN多克隆抗体(货号251319, 深圳市豪地华拓生物); E-cadherin多克隆抗体(货号ABP57182, 艾美捷科技); 即用型SP免疫组织化学试剂盒(货号CDJ-1593C-SJH, 武汉纯度生物); 实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)试剂盒[货号HEPENGBIO-TG646，赫澎(上海)生物]。

1.3 方法

1.3.1 样本采集: 良性胃溃疡组取患者胃镜活检组织作为样本，溃疡型胃癌组取患者手术切除胃癌组织作为样本。用生理盐水清理组织样本，一部分样本于甲醛固定、石蜡包埋后进行5 μm切片，一部分样本于-80 ℃保存。

1.3.2 免疫组织化学法检测PGRN、E-Cadherin蛋白表达: 将上述石蜡切片进行二甲苯脱蜡、水化，并用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗5 min。先根据试剂盒说明书进行SP法染色，再用苏木精复染、重新水化后封片进行观察。结果判定: ① 染色强度，未染色记0分，弱阳性染色记1分，中等阳性染色记2分，强阳性染色记3分; ② 阳性细胞占比，≤25%为0分, >25%～50%为1分, >50%～75%为2分, >75%为3分。染色强度评分和阳性细胞占比评分的乘积即染色指数(SI), SI≤1判为阴性, SI>1～3判为弱阳性, SI>3～<6判为中等阳性, SI≥6判为强阳性[7]。

1.3.3 qRT-PCR检测组织中PGRN、E-CadherinmRNA表达: 将组织置于液氮预冷的研钵中研磨后，加入TRIzol试剂提取总RNA, 经反转录为cDNA后行qRT-PCR扩增，以β-actin为内参，用2-△△CT法分析PGRN、E-CadherinmRNA表达水平，引物见表1。

表1 qRT-PCR引物

1.4 随访方法

通过电话随访或入院复查方式进行为期3年的跟踪随访，记录患者预后生存情况，截止时间为患者死亡时间或2020年7月。

1.5 统计学分析

2 结 果

2.1 一般资料比较

2组患者年龄、体质量指数、性别比较，差异无统计学意义(P>0.05); 溃疡型胃癌组患者病程短于良性胃溃疡组, Hp感染率高于良性胃溃疡组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 2组患者一般资料比较

2.2 组织样本中PGRN、E-Cadherin蛋白阳性表达情况

免疫组织化学检测结果显示，溃疡型胃癌组PGRN蛋白阳性表达率高于良性胃溃疡组, E-Cadherin蛋白阳性表达率低于良性胃溃疡组，差异有统计学意义(χ2=30.721、14.463,P<0.001), 见图1、表3。

A: PGRN蛋白在良性胃溃疡组织中阳性表达; B: PGRN蛋白在溃疡型胃癌组织中阳性表达; C: E-Cadherin蛋白在良性胃溃疡组织中阳性表达; D: E-Cadherin蛋白在溃疡型胃癌组织中阳性表达。图1 PGRN、E-Cadherin蛋白在良性胃溃疡组织、溃疡型胃癌组织中的阳性表达情况(免疫组织化学法,放大400倍)

表3 2组组织样本中PGRN、E-Cadherin蛋白表达情况比较[n(%)]

2.3 组织样本中PGRN、E-Cadherin mRNA表达水平

qRT-PCR检测结果显示，溃疡型胃癌组PGRNmRNA表达水平高于良性胃溃疡组,E-CadherinmRNA表达水平低于良性胃溃疡组，差异有统计学意义(t=9.674、10.802,P<0.001), 见表4。

表4 2组组织样本中PGRN、E-Cadherin mRNA表达水平比较

2.4 良性胃溃疡和溃疡型胃癌组织中PGRN、E-Cadherin蛋白阳性表达的相关性分析

Spearman相关分析法结果显示，良性胃溃疡组织中, PGRN、E-Cadherin蛋白阳性表达呈负相关(r=-0.529,P<0.001), 见表5; 溃疡型胃癌组织中, PGRN、E-Cadherin蛋白阳性表达呈负相关(r=-0.426,P<0.001), 见表6。

表5 良性胃溃疡组织中PGRN、E-Cadherin蛋白表达的相关性分析

表6 溃疡型胃癌组织中PGRN、E-Cadherin蛋白表达的相关性分析

2.5 良性胃溃疡和溃疡型胃癌组织中PGRN、E-Cadherin mRNA表达水平的相关性分析

Pearson相关分析法结果显示，良性胃溃疡组织、溃疡型胃癌组织中,PGRN、E-CadherinmRNA表达水平均呈负相关(r=-0.441、-0.306,P<0.001), 见图2、图3。

图2 良性胃溃疡组织中PGRN、E-Cadherin mRNA表达水平的相关性

图3 溃疡型胃癌组织中PGRN、E-Cadherin mRNA表达水平的相关性

2.6 PGRN、E-Cadherin蛋白阳性表达率与溃疡型胃癌患者临床病理参数的关系

不同性别、年龄、肿瘤直径、溃疡部位患者的溃疡型胃癌组织PGRN、E-Cadherin蛋白阳性表达率比较，差异无统计学意义(P>0.05); 有淋巴结转移、浸润程度T3～T4期、低分化和TNM分期Ⅲ～Ⅳ期患者的PGRN蛋白阳性表达率分别高于无淋巴结转移、浸润程度T1～T2期、高分化和TNM分期Ⅰ～Ⅱ期患者, E-Cadherin蛋白阳性表达率分别低于无淋巴结转移、浸润程度T1～T2期、高分化和TNM分期Ⅰ～Ⅱ期患者，差异有统计学意义(P<0.05)。见表7。

表7 不同临床病理特征溃疡型胃癌患者PGRN、E-Cadherin蛋白阳性表达情况比较[n(%)]

2.7 PGRN、E-Cadherin mRNA单独和联合应用对溃疡型胃癌的诊断价值

ROC曲线显示,PGRNmRNA诊断溃疡型胃癌的曲线下面积(AUC)为0.855(95%CI: 0.803～0.907), 敏感度为75.29%, 特异度为87.06%, 截断值为1.229;E-CadherinmRNA诊断溃疡型胃癌的AUC为0.908(95%CI: 0.868～0.949), 敏感度为75.24%, 特异度为94.12%, 截断值为0.892;PGRN、E-CadherinmRNA联合诊断溃疡型胃癌的AUC为0.959(95%CI: 0.935～0.984), 敏感度为80.91%, 特异度为82.33%;PGRNmRNA联合E-CadherinmRNA诊断溃疡型胃癌的AUC显著大于PGRN、E-CadherinmRNA单独诊断的AUC(Z=3.471,P<0.001;Z=0.039,P=0.019)。见图4。

图4 PGRN、E-Cadherin mRNA单独和联合诊断溃疡型胃癌的ROC曲线

2.8 溃疡型胃癌影响因素的Logistic回归分析

Logistic回归分析发现, TNM分期、淋巴结转移、分化程度、浸润程度、PGRN蛋白表达和E-Cadherin蛋白表达均为溃疡型胃癌的独立影响因素(P<0.05), 见表8。

表8 溃疡型胃癌影响因素的多元Logistic回归分析

2.9 PGRN、E-Cadherin蛋白表达与溃疡型胃癌患者生存预后的关系

3年随访结果显示, 105例溃疡型胃癌患者中, 31例死亡, 74例生存，生存率为70.48%。PGRN蛋白阳性表达患者生存率为66.67%, PGRN蛋白阴性表达患者生存率为93.33%, 差异有统计学意义(Log-rankχ2=3.884,P=0.049), 见图5; E-Cadherin蛋白阳性表达患者生存率为90.91%, E-Cadherin蛋白阴性表达患者生存率为55.74%, 差异有统计学意义(Log-rankχ2=15.422,P<0.001), 见图6。由此表明，溃疡型胃癌组织中PGRN蛋白阳性表达、E-Cadherin蛋白阴性表达均与患者3年生存预后不良相关(P<0.05)。

图5 溃疡型胃癌组织中PGRN蛋白表达情况与患者生存预后的关系

图6 溃疡型胃癌组织中E-Cadherin蛋白表达情况与患者生存预后的关系

3 讨 论

胃溃疡是临床常见的胃部疾病，其中良性胃溃疡是Hp感染、胆汁反流等多种因素使得胃液中H+与胃黏膜接触造成的黏膜屏障损坏，病程长，而恶性胃溃疡是由恶性肿瘤向浆膜方向生长供血不足而局部脱落坏死所形成的凹陷，病程短[8]。溃疡型胃癌是由胃黏膜病变引发的癌变，因此监测病情发展可预防癌变的发生，而分析良恶性胃溃疡的临床特征对患者病情诊断和治疗方案制订具有重要作用[9]。

PGRN表达于多种细胞内，在肿瘤发生、癌症扩散、胚胎发育、炎症调节、伤口愈合中起着重要作用，已被用作肿瘤标志物[10-11]。相关报道[12-13]称,PGRN基因敲除可阻断小鼠核因子κB(NF-κB)通路，抑制JAK激酶(JAK)/信号传导与转录激活因子3(STAT3)信号通路的激活，从而抑制乳腺癌细胞的迁移和侵袭。李媛媛等[14]研究表明, PGRN在胃肠道间质瘤患者瘤组织中的阳性表达率显著增高，与患者预后不良相关。PGRN在胃癌组织中的免疫反应性显著增强，且与肿瘤病理学分期密切相关。本研究发现，与良性胃溃疡组相比，溃疡型胃癌组PGRN蛋白阳性表达率显著增高，与相关研究[14]结论一致，提示PGRN表达增加可能与胃癌的发生相关。

E-cadherin在细胞膜上可通过相互作用确保细胞间的紧密接触，研究[6]发现胃癌的发生与上皮钙黏蛋白的表达异常有一定关系。抑制E-cadherin表达可促进上皮-间充质转化(EMT), 并减少细胞间相互作用[6]。E-cadherin参与多种信号通路，其表达降低可导致β-连环蛋白过度积累激活Wnt靶基因表达，从而促进细胞增殖和肿瘤发生[15]。在胃癌组织中, E-cadherin表达显著降低，且与淋巴结转移、浸润程度、TNM分期关系密切[16]。相关研究[17]表明, E-cadherin表达下调能促进胃癌细胞SGC7901的增殖和转移，这可能与其抑制细胞凋亡有一定关联。本研究发现，与良性胃溃疡组相比，溃疡型胃癌组E-Cadherin蛋白阳性表达率显著降低，与相关研究[16]结果一致，提示E-Cadherin表达降低可能参与胃溃疡患者的癌变过程。

研究[5]表明，微小RNA-29b-3p(miR-29b-3p)可通过靶向PGRN来改变下游Wnt信号传导，刺激EMT发生[18], 然而抑制E-cadherin表达亦可促进EMT的发生。本研究发现, PGRN表达与E-cadherin表达呈负相关，表明两者可能相互作用并共同影响胃溃疡的疾病进展。本研究还发现,PGRN、E-CadherinmRNA联合诊断溃疡型胃癌的AUC相较两者单独诊断时显著增加，溃疡型胃癌组织中PGRN、E-Cadherin蛋白表达与淋巴结转移、浸润程度、分化程度和TNM分期有关，且PGRN蛋白阳性表达和E-Cadherin蛋白阴性表达均为溃疡型胃癌的独立危险因素，与相关研究[14, 16]结果一致。由此表明, PGRN、E-cadherin对溃疡型胃癌具有较好的诊断价值，可作为早期诊断及临床监测指标应用于良恶性胃溃疡患者中，从而改善治疗效果。本研究结果还显示，溃疡型胃癌组织中PGRN蛋白阳性表达、E-Cadherin蛋白阴性表达均与患者3年生存预后不良相关，表明PGRN、E-cadherin可用于溃疡型胃癌患者的生存预后分析，监测PGRN、E-cadherin水平并尽早治疗，可能对延长患者生存期具有一定作用。

综上所述，与良性胃溃疡组织中相比，溃疡型胃癌组织中PGRN表达显著增加, E-Cadherin表达显著降低; PGRN、E-cadherin对溃疡型胃癌具有较高的诊断价值，且两者与溃疡型胃癌患者的临床病理特征和生存预后有关。本研究初步探讨了PGRN、E-Cadherin在良恶性胃溃疡中的表达及临床意义，对患者的临床特征分析和预后评估具有一定参考价值，未来有待进一步探究两者在良恶性胃溃疡中的具体作用机制。