翁志华, 王 磊, 周 俊

(1. 江苏省扬州市第二人民医院 呼吸内科, 江苏 扬州, 225002;2. 扬州大学附属医院 呼吸与危重症医学科, 江苏 扬州, 225009)

在全球人类的恶性肿瘤中，肺癌发病率居首位，且其复发率和病死率也位居癌症前列[1]。肺腺癌(LAC)是肺癌常见的病理类型，属非小细胞肺癌(NSCLC)范畴，其发病率和病死率逐年上升[2-3]。尽管医学诊疗手段不断进步，但肺癌的诊断和治疗效果还有待提高，故寻找新的肺癌诊断和预后判定指标以及分子治疗方案十分重要。小的非编码RNA如微小RNA(miRNAs)、Piwi-相互作用RNA (piRNAs)、环状RNA (circRNAs)和tRNA衍生的RNA碎片(tRFs)等与癌症密切相关[4-6]。tRFs长度为14～35 nt, 其在特定环境中总是从tRNA的5′端或3′端派生碎小片段。目前, tRFs的生物学功能仍然未知，其已逐步成为肿瘤研究的热点之一。Leu(CAG)-tRNA(tRF-LeuCAG)在NSCLC组织中表达水平高于癌旁正常组织，通过提高AURKA表达水平可加速细胞周期，促进细胞增殖，可以作为NSCLC分子标志物[7]。本研究探讨了tRF-LeuCAG在68例LCA组织中的作用和影响，发现tRF-LeuCAG在LAC中有促进淋巴结转移、诊断及评估预后的作用。

1 资料与方法

1.1 标本和资料收集

本研究的68对LAC组织和癌旁正常肺组织(距离癌灶周边3 cm以上没有肿瘤细胞的正常肺组织)为2018年1月—2019年4月扬州大学附属医院胸外科手术切除标本。患者年龄42～70岁，男40例，女28例。纳入标准: ① 临床、病理数据完整无缺失者; ② 经病理学检查确诊为LAC者; ③ 初治，术前未接受放化疗、免疫治疗等抗肿瘤治疗者; ④ 患者知情同意，经扬州大学附属医院伦理委员会备案。排除标准: ① 伴有其他恶性肿瘤者; ② 有重要器官功能障碍者; ③ 依从性较差者。所有患者临床病理特征包括年龄、性别、吸烟、肿瘤大小、病理分级、淋巴结转移(NM)和临床TNM分期[分期标准采用国际抗癌联盟(UICC)第8版]。新鲜LAC组织采集后，除实验使用外，剩余组织放入液氮罐里，于-80 ℃冰箱内长期保存，以备后期实验所用。

1.2 细胞和质粒

LAC细胞株A549、NCI-H1975和正常支气管上皮细胞16HBE购自中科院上海生物细胞库。细胞培养在含有10%胎牛血清(FBS, HyClone公司)、120 IU/mL青霉素和120 mg/mL链霉素的DMEM培养液中，加湿培养箱的温度为37 ℃, 内含5%二氧化碳。tRF-LeuCAG模拟物/抑制剂和阴性对照品(NC)均购自广州RIBOBIO生物科技有限公司。

1.3 细胞转染实验

使用InvitrogenTMLipofectamine 3000 (Life Technologies, 美国)进行细胞转染。根据实验说明书，将200 nmol/L的tRF-LeuCAG实验组和空白对照组的产品(RIBOBIO, 广州)瞬时转染至肺癌细胞中。转染后24～48 h进行后续实验处理，其中包括增殖和细胞周期分析。

1.4 实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)

LAC标本和细胞总RNA分离使用TRIzol试剂(Invitrogen公司)，得到的总RNA的光密度(OD)260 nm/OD230 nm值大于1.8。根据试剂盒说明书使用Takara公司的PrimeScriptTMⅡ1st Strand cDNA Synthesis试剂盒，将总RNA逆转录成cDNA。按照实时荧光定量PCR试剂盒(Takara)的步骤操作说明，在Applied Biosystems 7500 PCR仪器上进行qRT-PCR。tRF-LeuCAG上游引物为GCCGAGCGGTCTAAGGCGC, 下游引物为通用引物。tRF-LeuCAG的相对定量是通过内参U6表达水平的标准化获得。U6上游引物为AGAGAAGATTAGCATGGCCCCTG, 下游引物为CAGTGCAGGGTCCGAGGT。

1.5 RNA原位分子杂交(RISH)检测tRF-LeuCAG的表达

68例LAC组织及癌旁正常组织石蜡包埋后，组织切片脱蜡至水。室温下H2O2处理后，使用胃蛋白酶消化组织切片以便暴露核苷酸片段。滴加预杂交液放置培养箱中孵育组织切片，然后加入杂交液孵育12 h。清洗后加入密封液。加入生物素化地高辛。组织中加入链霉亲和素-生物素复合物(SABC)。加入生物素化过氧化物酶。组织进行DAB染色、苏木精复染、洗涤、脱水、透明、封闭。用预杂交液代替含有探针的杂交液作为空白对照，探针序列为GTCAGGATGGCCGAGCGGTCTAAGGCGC。

1.6 Transwell实验检测tRF-LeuCAG对LAC细胞的迁移情况

各组肺癌细胞分别用无血清DMEM培养液制备成细胞悬液(约含1 × 105个细胞)。将0.2 mL细胞悬液吸取至Transwell小室的上室内，并将20%FBS的DMEM培养液0.6 mL吸至Transwell小室的下室内，置于有湿度的CO2培养箱内孵育24～48 h。小室取出后用棉签擦掉没穿膜的肺癌细胞，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后添加95%乙醇固定20 min, 再用结晶紫染色。随机选择5个高倍视野，在光学显微镜下计数迁移细胞数目，分析肺癌细胞的迁移情况。

1.7 统计学分析

2 结 果

2.1 tRF-LeuCAG在LAC中的表达及与临床病理特征的关系

qRT-PCR实验结果(图1)表明, 68例LAC组织中tRF-LeuCAG的表达量为(6.76±1.39), 癌旁正常组织(NC)中的表达量为(3.52±1.02)，提示LAC组织中tRF-LeuCAG表达水平高于癌旁正常组织，差异有统计学意义(P=0.031)。在淋巴结(NM)转移方面，淋巴结转移组(NM+,n=29)tRF-LeuCAG表达量为(7.76±1.93), 高于无淋巴结转移组(NM-,n=39)的(2.52±1.12), 差异有统计学意义(P=0.015)。tRF-LeuCAG的表达与LAC的分化程度和淋巴结转移密切相关(P<0.05), 但与年龄、性别、吸烟、肿瘤直径、肿瘤分级及TNM分期无相关性(P>0.05)。见表1。

与对应组织比较, *P<0.05。图1 tRF-LeuCAG在不同组织中的表达量

表1 tRF-LeuCAG表达水平与LAC临床病理特征的关系

2.2 tRF-LeuCAG在LAC中的阳性表达情况

采用RISH检测68对LAC组织和癌旁肺组织中 tRF-LeuCAG的阳性表达情况。RISH结果表明，在LAC中RF-LeuCAG主要为阳性表达，阳性颗粒为棕黄(褐)色，大小不一、颜色深浅不一，分布在细胞质(浆)中，见图2。在LAC组织中tRF-LeuCAG的阳性率为73.53%(50/68), 高于邻近正常肺组织的13.24%(9/68), 差异有统计学意义(χ2=5.246,P=0.022), 见表2。本实验结果再次验证了tRF-LeuCAG在LAC中表达水平上调。

A、B: LAC组织中tRF-LeuCAG阳性表达图; C: LAC组织中tRF-LeuCAG阴性表达图; D、E: 癌旁正常肺组织中tRF-LeuCAG阴性表达图; F: 癌旁正常肺组织中tRF-LeuCAG阳性表达图。B、E放大倍数为400倍,其余放大倍数为200倍。图2 tRF-LeuCAG在LAC组织和癌旁正常组织中的表达

表2 tRF-LeuCAG和CEA表达水平对肺腺癌的诊断价值

2.3 tRF-LeuCAG和癌胚抗原(CEA)表达水平对LAC的诊断价值

CEA是LAC常用的肿瘤检测标志物，故本研究将CEA作为对比参数。ROC曲线结果显示，在LAC组织中tRF-LeuCAG和CEA诊断效能指标见表2、图3, 提示tRF-LeuCAG和CEA在LAC组织中诊断效能几乎一致，推测tRF-LeuCAG未来可能成为新的LAC检测生物分子标志物。

图3 tRF-LeuCAG和CEA水平诊断LAC的ROC曲线

2.4 tRF-LeuCAG与LAC患者生存预后的关系

根据qRT-PCR结果, 68例LAC组织中tRF-LeuCAG表达水平(大于其在癌旁正常组织的表达水平)升高的病例有53例(升高组)，其余表达水平正常或下降的病例有15例(正常和下降组)。升高组的3年中位总生存时间(OS)为14个月(四分位区间为 6～28个月)，正常和下降组中位OS为22个月(四分位区间为11～36个月)。升高组OS短于正常和下降组，差异有统计学意义(χ2=13.72,P=0.002;HR=2.968, 95%CI为1.669～5.277), 见图4。

图4 tRF-LeuCAG表达水平与患者3年预后的生存曲线图

2.5 tRF-LeuCAG促进肺癌细胞迁移

上述研究表明tRF-LeuCAG与患者的淋巴结转移密切相关，因此通过Transwell迁移实验进一步研究tRF-LeuCAG对肺癌转移的影响。首先通过qRT-PCR验证过表达tRF-LeuCAG(过表达组)和降低tRF-LeuCAG表达(降低表达组)的有效性(图5A、5B)。Transwell迁移实验结果显示(图5C、5D), 过表达tRF-LeuCAG促进了肺癌细胞A549和NCI-H1975的迁移，而降低tRF-LeuCAG表达则阻碍了迁移(P<0.05), 提示tRF-LeuCAG能促进肺癌细胞迁移，进而向远处器官转移。

A、B: qRT-PCR证实tRF-LeuCAG在A549和NCI-H1975细胞中过度表达或降低表达有效; C、D: Transwell实验检测A549和H1650细胞的迁移情况。与对照组比较, *P<0.05。图5 tRF-LeuCAG促进肺癌细胞迁移(放大倍数400倍)

3 讨 论

目前，肺癌发病率居各类肿瘤首位，也是癌症死亡的常见类型[8-9]。肺癌患者死亡的原因主要为肺癌的转移、复发和耐药性[10], 因此寻找肺癌诊断、治疗和预后评估的分子标志物变得越来越迫切。

转运RNA (tRNAs)是一种经典的非编码RNA，能将信使RNA (mRNA)上的遗传信息转化为氨基酸序列信息，从而合成蛋白质。在内分泌失调、缺氧等应激条件作用下，tRNA裂解出许多碎片，包括tiRNAs和tRFs。研究[11-13]表明tRNA片段可作为信号分子和基因表达的调控因子，在肿瘤、代谢性疾病和神经系统疾病等重大疾病中具有重要的调控作用。在肺癌研究中，无论是在患者血浆还是在肺癌组织中，正常人和LAC患者的tRNA片段分布都存在显著差异，其中tRF-16-L85J3KE、tRF-21-RK9P4P9L0和tRF-16-PSQP4PE参与了许多癌症的信号途径，能作为新的诊断生物标志物和治疗的靶点[14]。一项研究[15]通过基因测序验证了3个tRF(tRF-Ser-TGA-010、tRF-Arg-CCT-018和tRF-Val-CAC-017)在LAC组织中呈低表达水平，这些下调的tRF-1可能参与LAC的发病机制，并可能作为潜在的生物诊断标志物，或协调药物开发的靶基因。研究[7]发现, tRF-LeuCAG表达水平升高并在NSCLC中得到了验证; 在肺癌细胞H1299功能研究中得出抑制tRF-LeuCAG的表达则能抑制细胞增殖并阻碍细胞周期; tRF-LeuCAG可能参与调节NSCLC的发生并可能成为NSCLC潜在的治疗靶点。然而，关于tRF-LeuCAG调控LAC细胞迁移和转移的影响和作用，以及其能否作为诊断和预后评估的指标的研究较少。

本研究通过qRT-PCR和RISH检测发现，tRF-LeuCAG在LAC组织中表达水平显著上调并与淋巴结转移密切相关，即tRF-LeuCAG表达水平越高，LAC的分化程度越低，且患者淋巴结转移的可能性就越大。过表达tRF-LeuCAG促进肺癌细胞的迁移，降低tRF-LeuCAG表达则抑制了细胞的迁移。这些结果表明在LAC的发生发展过程中, tRF-LeuCAG可能起到促癌基因和促迁移、转移的作用。ROC曲线分析表明, tRF-LeuCAG和CEA的诊断效能基本一致，推测tRF-LeuCAG也可能在不久的将来作为LAC诊断的一种新的分子标志物。本研究与相关研究[4, 13]均证实tRNA碎片可能会成为肿瘤的诊断指标。本研究结果表明, tRF-LeuCAG升高组的3年OS为14个月，而正常和下降组中位OS为22个月，升高组OS显著短于正常和下降组。这一结果再次证实了检测tRF-LeuCAG表达对提高LAC治疗效果和预后评估有重要的临床意义。此外, tRF-LeuCAG表达也与肿瘤的分化相关，而分化也反映了肿瘤的恶性程度和预后: 分化越低的肿瘤组织越会出现tRF-LeuCAG高表达，因而LAC恶性程度高，患者预后差、生存时间较短; 高表达的tRF-LeuCAG预示着肿瘤细胞容易有淋巴结转移，同样患者预后较差，与相关研究[7, 14]结果相一致。上述结果表明tRF-LeuCAG可作为LAC患者预后评估的一个的强有力的生物学指标。但本研究存在一定局限性，仅研究了tRF-LeuCAG对诊断和预后的影响以及对肿瘤细胞迁移的作用，没有研究tRF-LeuCAG对转移作用的具体调控机制，这将会在今后的实验中继续探讨。

综上所述，检测tRF-LeuCAG在LAC组织中的表达具有临床病理意义，该指标未来可能成为LAC患者诊断、生存期评估的新型标志物。本研究为寻找LAC个性化治疗和诊断、预后评估指标提供了有临床价值的理论依据。