聂圆圆 王芷晴 谭晓桐 姜海强 安 龙 赵 鑫

(1.东北大学资源与土木工程学院,辽宁 沈阳 110819;2.深部金属矿山安全开采教育部重点实验室,辽宁 沈阳 110819)

随着我国经济和工业的日益发展,传统粗放型的经济增长模式在资源开发与环境保护方面的矛盾日趋凸显,长期堆存的大量尾矿造成的环境负担愈发严重。经粗略统计,目前我国大约存有1.3万座尾矿库,有超过70亿t的尾矿堆存,其中,金属尾矿占比超过90%[1]。由于早期选矿工艺落后,很多尾矿中仍含有大量贵金属和稀土元素有待回收[2]。研究人员针对尾矿中有价金属的回收开展了较多的研究,微生物浸出技术因其成本低、环境友好、原位浸出、产生有毒物质较少、不涉及有毒化学品等优点受到广泛关注[2]。

生物浸出技术又称湿式冶金技术,利用微生物在生命活动中自身的氧化和还原特性,使资源中目标成分氧化或还原,在水溶液中以离子态或沉淀的形式与原物质分离[3]。该技术主要应用于低品位矿和尾矿。据统计,我国已有数十个低品位铜矿探索或成功应用了生物浸铜技术[4]。尾矿中金属的溶解不仅与矿物组成有关,也取决于微生物的浸出能力[3]。嗜酸氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillusferrooxidans,At.f)是浸出硫化矿中有价金属的重要功能菌,可以氧化FeSO4和硫化矿中的Fe2+、单质硫、还原性化合物和硫化矿物等,获得生长所需的能量[5],在含有铜、锌、铁、钴、钼、镍等金属的矿物浸出领域有较多应用。但是,环境中微生物的特定功能和效率会因其生长和分离的环境存在较大差异,选择适宜的环境,筛选获得更加高效的浸矿功能菌种,对提升尾矿资源化具有重要意义。

本研究以山东省某金属矿的酸性矿井水为接种物,定向富集并筛选获得1株嗜酸铁氧化细菌,通过理化特征和16S rDNA基因测序鉴定其属于A.ferrooxidans。探究细菌接种量和矿浆浓度对其生长活性和Cu2+、Zn2+浸出效率的影响。利用该细菌在最适生长条件下,对金都矿业尾矿中的有价金属进行浸出,探究金属的浸出效率与浸矿特征。

1 试验材料和方法

1.1 尾矿样品

试验尾矿采自金都矿业的多金属硫化矿的尾矿库,经研磨至粒度为 75μm。通过 X射线衍射(XRD)分析,主要成分为二氧化硅(SiO2)、黄铁矿(FeS2)、黄铜矿(CuFeS2)和闪锌矿(ZnS)等。采用X射线荧光光谱(XRF)分析显示,Cu和Zn的含量分别为 4.65%和 2.50%,Fe、Al、Mg、Pb、Ti、Sb 的含量分别为33.99%、3.99%、1.04%、1.15%、0.07%、0.08%;SiO2和SO3的含量分别为21.09%和8.20%,其余是少量的非金属元素。

1.2 接种物与培养基

富集接种物为山东省某金属矿的酸性矿井水,深黄色,含有少量悬浮物,pH=2.7±0.2。使用9K培养基定向富集和筛选嗜酸浸矿功能细菌[6]。9K培养基制备方法为:将(NH4)2SO43.0 g、KCl 0.1 g、K2HPO40.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g和Ca(NO3)20.01 g溶于600 mL去离子水,用1∶1的H2SO4调至pH=2.0,获得基础盐溶液A液;FeSO4·7H2O 44.8 g溶于400 mL去离子水,同样方法调至pH=2.0,获得亚铁溶液B液。溶液A于121℃高压灭菌10min;溶液B使用0.22μm滤膜过滤灭菌,接种前混合两种溶液。9K固体培养基:在未调pH值的A液中加入15 g琼脂,高压灭菌,待降温至60℃,与经过滤灭菌的B液混合,分装入灭菌培养皿待用[6]。

1.3 功能菌的定向富集与分离纯化

取5 mL接种物至100mL的9K培养基中,在30℃、140 r/min的恒温空气浴振荡培养,监测Fe2+氧化速率判断嗜酸性铁氧化细菌的生长情况。接种5 d后开始取样,之后每天取样1次,测定溶液的Fe2+浓度,计算Fe2+氧化率,至其趋近于100%时结束。为了提升目标功能细菌的相对数量,以第一轮富集菌液为接种物,以5%的接种量转接入新的培养基,连续转接多代并定向富集,直至功能细菌可以快速达到对数期。收集菌液,委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行MiSeq测序,进行菌群分析,进一步判断定向富集效果。以富集效果较好的功能菌液为接种物,使用平板划线法对目标细菌进行分离,恒温培养至菌落形成,挑取外观均匀的菌落,接种至9K液体培养基,30℃、140 r/min振荡培养至呈红棕色,重复至菌株为纯菌。

1.4 形态观察与系统发育鉴定

离心收集对数期的菌体,使用PBS缓冲液冲洗2次,取1滴菌液置于铜网表面,使用2%磷钨酸进行负染色40 s,风干后使用透射电子显微镜(JEMARM200F,JEOL)观察细菌的形态结构。

使用细菌基因组DNA提取试剂盒(D1600,Solarbio)提取基因组DNA。使用16S rDNA基因通用引物BSF8/27(5'-AGA GTT GAT CCT GGC TCA G)和BSR1492(5'-TAC GGY TACCTTGTT ACG ACT T)扩增目标基因[7]。PCR产物经克隆后,委托生工生物工程(上海)股份有限公司测序。测序结果使用Blast_W与GenBank数据库中序列比对,使用MEGA 6.0构建系统发育进化树。

1.5 微生物浸矿试验

向含有85mL的9K培养基的锥形瓶中加入10 g灭菌的尾矿砂,以体积分数15%接种对数期菌液,矿浆浓度100 g/L,初始pH=2.0;空白对照组以无菌水代替菌液。30℃、130 r/min振荡浸矿28 d。每2 d取样1次,测定体系中Cu2+和Zn2+的含量。

1.6 测试分析方法

全部试验设置3组平行重复。使用pH计(PB-10,Sartorius)测定溶液的pH值[6];邻菲啰啉分光光度法测定溶液的Fe2+含量[5];X射线衍射(XRD)分析原矿样的组成[8];电感耦合等离子体原子发射光谱(ICP-AES)测定原矿样和浸出液中铜和锌的含量。金属浸出率计算公式如下:

2 试验结果与讨论

2.1 浸矿功能菌富集与筛选

2.1.1 菌株富集与纯化

以酸性矿井水为接种物富集目标细菌,通过监测Fe2+氧化速率来考察浸矿功能菌的生长情况。富集初期,细菌生长缓慢,第12 d观察到菌液由浅绿色变为红棕色,此时Fe2+氧化率为39.55%,在第14 d时,Fe2+氧化率达到99.5%。进行多次转接富集以提升目标细菌的适应性和增殖速率,经连续转接多代后,第1 d的Fe2+氧化率即可与富集初期第7 d的水平相当,且仅需2 d即可达到对数生长期,Fe2+可全部被氧化。对其中氧化效率最高的样品进行MiSeq测序,对比富集前后的菌群在属水平的相对丰度差异,结果如图1所示。原始接种物中含有的浸矿功能细菌包括Acidithiobacillus、Leptospirillum和Acidiphilium,所占比例分别为0.01%、0.37%和1.41%,经定向富集后,Acidithiobacillus和Acidiphilium成为优势菌属,分别占比43.58%和22.18%,Leptospirillum消失,推断其原因是该菌属不适宜所选富集条件。MiSeq测序结果表明,9K培养基对目标细菌富集效果较好,Acidithiobacillus比例提升至富集前的7 000倍。采取平板划线法在9K固体培养基上对目标菌进行分离纯化,恒温培养至第8 d时形成针尖大小的圆形菌落。挑取外观均匀的菌落,分别接种至9K液体培养基中,30℃、140 r/min振荡培养至培养液呈红棕色,重复此过程,最终纯化获得7株细菌,进一步测定其Fe2+氧化速率,优选出效率最高的菌株WT2020,在36 h内的Fe2+氧化率可达99.49%。

图1 富集前后的浸矿功能菌群组成Fig.1 Microbial diversity of before and after leaching enrichment

2.1.2 功能菌株的鉴定

菌株WT2020在9K固体培养基上生长缓慢,35℃培养8 d形成直径约0.5 mm的黄色圆形单菌落,表面湿润。 菌体约(0.2～0.4)×(1.0～1.2)μm,呈短杆状,无鞭毛(如图2所示)。

图2 菌株WT2020的TEM显微照片Fig.2 The TEM micrograph of strain WT2020

使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株WT2020基因组DNA。获得16S rDNA基因1458 bp的片段,与GenBank数据库比对,系统发育进化关系如图3所示。同源比对分析显示,与Acidithiobacillus ferrooxidansATCC 23270T(NR074193)的亲缘性最近,相似度为99.52%;然后是A.ferriduransATCC 33020T(AJ278719),相似度为98.79%。结合其生理生化特征,判断该菌株属于氧化亚铁硫杆菌属,初步命名该菌株为A.ferrooxidansWT2020。目前,该菌属仅发现9个菌种,彼此间16S rDNA基因相似度较高。

图3 菌株W T2020的系统发育进化关系Fig.3 Phylogenetic relationship of strain WT2020

2.2 菌株WT2020的铁氧化活性

生物浸矿过程容易受pH值、温度、接种量和矿浆浓度等多种因素影响,前人的大量研究表明,浸矿细菌在pH=2.0、30℃时生长活性最高,接种量和矿浆浓度对其生长影响较大[8]。因此,菌株WT2020的最适接种量和矿浆浓度对后续研究和实际应用有重要意义。

2.2.1 细菌接种量的影响

细菌接种量直接决定细菌的繁殖速度和生化反应速率。考察接种量(0%、5%、10%、15%和20%)对菌株WT2020生长的影响。如图4所示,细菌进入生长对数期的时间随着接种量的增加而缩短,氧化效率也明显提高。接种量为15%和20%时,Fe2+氧化率在36 h时达到稳定,接近100%,而接种量为5%和10%时,则需要48 h,说明接种量较低会延长细菌的生长延滞期。但是,接种量过高不仅增加浸矿成本,而且某些具有抑制和毒害作用的代谢产物会随接种物进入浸矿体系,降低浸出效率[8]。因此,15%的接种量较为适宜。张旭[9]等探究接种量对以黄铁矿培养Acidithiobacillus生长的影响,在黄铁矿矿浆浓度为10 g/L,溶液初始pH=2.0时获得最佳接种量,为15%,与本研究结果相同。

图4 接种量对菌株WT2020氧化活性的影响Fig.4 Effect of inoculum proportion on the oxidation activity of strain WT2020

2.2.2 矿浆浓度的影响

初始矿浆浓度会影响浸矿细菌的生长活性和铁氧化速率。 矿浆浓度(0、10、20、50和100 g/L)对细菌生长的影响如图5所示。加入矿样后,菌株WT2020进入生长对数期的时间推迟约12 h,说明氧化Fe2+的效率减弱。矿浆浓度越高,细菌氧化活性越低,但在60 h时,Fe2+氧化率都能接近100%,说明虽然菌株WT2020的氧化速率降低,但是仍然可以在高矿浆浓度条件正常生长。薛洪其[10]研究分离自钼镍矿废水的At.f菌对Cu2+和Zn2+的耐受性发现,At.f菌对Cu2+比较敏感,当Cu2+浓度为5.0 g/L时,细菌氧化活性受到明显抑制。而At.f菌对Zn2+具有较高的耐受性,在Zn2+浓度为10 g/L的环境下培养80 h时的Fe2+氧化率仍在99%以上。WANG[8]等研究At.f菌在不同矿浆浓度条件下对黄铜矿和硫化铜尾矿中Cu2+的浸出率,当黄铜矿中Cu2+浓度为16.48 g/L时,Cu2+的浸出率在75 d达到47%,而当Cu2+浓度为49.44 g/L时,Cu2+的浸出率仅为20%;当硫化铜尾矿中Cu2+的浓度为0.99 g/L时,Cu2+的浸出率较其他Cu2+浓度(0.099、0.495 和 2.97 g/L)更高,达到68%。虽然,以上浸矿研究均使用了At.f菌,但是由于其分离来源不同,菌株表现出对重金属的解毒能力不同,对相同金属离子的耐受能力和浸出率也存在差异[11],其实质是菌株的功能基因和蛋白活性的差异。与以往研究相比,菌株 WT2020可在 Cu2+浓度为3.78 g/L和Zn2+浓度为1.80 g/L时存活,并且具有较好的金属耐受性和氧化速率。

图5 矿浆浓度对菌株W T2020氧化活性的影响Fig.5 Effect of pulp density on the oxidation activity of strain WT2020

浸矿体系的pH受矿浆初始浓度的影响如图6所示,均呈先上升后下降的趋势,且矿浆浓度与终点pH值呈反相关。原因是前期为细菌生长的延滞期,产酸少于耗酸;当细菌到达生长对数期和稳定期,利用FeSO4和尾矿中的Fe2+氧化产生大量Fe3+和H+(反应如式(1)和(2)所示)[12],说明在不影响菌株生长的前提下,矿浆浓度越高,浸出率越高。因此,矿浆浓度对细菌生长活性具有重要意义。在生物浸矿的实际生产中,矿浆浓度的降低必然导致处理量的减小,影响生产效益。所以,在保证细菌正常生长的前提下,适当增加矿浆浓度有利于浸出效率的提升。菌株WT2020在矿浆浓度为100 g/L时仍具有很强的金属耐受性和氧化活性。

图6 矿浆初始浓度对体系pH值的影响Fig.6 Effect of initial pulp densities on the system's pH value

2.3 对多金属硫化尾矿的浸出

目前,最常用的生物浸出方式主要是直接浸出和间接浸出[4]。在直接浸出过程中,细菌将金属硫化物氧化成可溶性硫酸盐(式(3)和(4)所示);间接浸出过程则是细菌将溶液中Fe2+氧化成Fe3+后,Fe3+对金属硫化物的氧化,如式(5)所示。

在细菌接种量为15%、矿浆浓度为100 g/L的条件下,Cu2+和Zn2+在28 d的浸出率分别为55.23%和72.09%,空白组的浸出率分别为46.66%和38.37%。浸出率变化如图7所示,在两个体系中,Cu2+和Zn2+的浸出率都随时间延长而增加,但是有菌条件下的浸出率明显高于无菌条件。说明H+对尾矿中Cu2+和Zn2+的浸出占主导作用,菌株WT2020可通过自身代谢维持浸矿体系中适宜的酸度环境,产生的Fe3+可以持续氧化尾矿中的金属,在后期可达到更好的金属浸出效果。菌株WT2020具有强化硫化矿氧化的作用,并展现出很强的金属离子耐受能力。Cu2+的浸出率低于Zn2+,推断是由于金属在尾矿中的存在形式和电化学特性之间复杂的相互作用导致[13]。NGUYEN等[14]研究不同菌株对某铜银尾矿中 Mn2+、Zn2+和Cu2+的生物浸出,在利用不同的菌株和菌株组合的多次实验中,Cu2+的浸出率始终低于50%,而Mn2+的浸出率最高可达99.5%。后续研究发现,可交换态、碳酸盐结合态和铁锰氧化物结合态的金属比其他形式的金属更容易进入生物体被利用,而硫化物结合态、有机物结合态和残留态的金属则更稳定,生物可利用性较差。另外,黄铜矿(CuFeS2)通常具有较高的电化学电位,较难被氧化,而闪锌矿(ZnS)的电化学电位更低,易被氧化,因而 Cu2+和 Zn2+浸出效率不同[15]。

图7 Cu2+和Zn2+浸出率变化Fig.7 Variation of Cu2+and Zn2+leaching rates

3 结 论

以酸性矿井水为接种物,定向富集并分离获得1株嗜酸性铁氧化细菌,鉴定并命名为Acidithiobacillus ferrooxidansWT2020。接种量和矿浆浓度对菌株WT2020的氧化活性和金属的浸出率影响较大,最佳接种量和矿浆浓度分别为15%和100 g/L。在最佳接种量和矿浆浓度,30℃,130 r/min的条件对多金属硫化尾矿浸矿28 d,Cu2+和Zn2+的浸出率分别达55.23%和72.09%。由于金属的存在形式和电化学特性之间复杂的相互作用,以及菌株的喜好差异,导致不同金属浸出率的差异,未来可以尝试在不同生境条件下筛选更多的功能菌株,以菌种复配或微生物强化等技术针对性提升生物浸矿效率。