刘芸雅，刘哲鹏，王俊，梁会敏

艾塞那肽是一种胰高血糖素样肽-1（GLP-1）受体激动剂［1］。艾塞那肽特异性地作用于GLP-1 受体，通过环磷酸腺苷和/或其他细胞内信号传导通路的作用，增加葡萄糖依赖性的胰岛素合成和体内胰腺β 细胞的胰岛素分泌，抑制胰高血糖素的过量分泌，并延缓胃排空，从而良好地控制血糖水平［2］。但是艾塞那肽作为多肽类药物，在体内稳定性差导致了其生物半衰期短，口服吸收差，生物利用度低［3］。目前只能采用注射方式给药，导致病人治疗依从性低，使得其临床应用大受限制［4］。已有很多研究开始关注艾塞那肽缓释口服制剂的开发。通过聚合物制备纳米粒可以将多肽和蛋白质类药物包裹于其中，从而增加了药物在胃肠道中的稳定性，同时也可促进小肠上皮细胞对药物的吸收，可以提高药物的生物利用度［5］。

聚乳酸-羟基乙酸共聚物［poly（actic-co-glycolic acid），PLGA］是一种生物可降解聚合物材料，用作纳米粒载体可以保护药物减少胃肠道的降解，增加了药物稳定性，从而提高生物半衰期，同时PLGA 的缓释作用还能控制药物缓慢释放从而达到长效缓释靶向目的［6］。PLGA 纳米粒具有疗效稳定、生物相容性好与用量少等特点［7］。因此本研究选用PLGA作为纳米粒载体材料。

本研究以PLGA 为载体，采用乳化复乳法（水包油包水，W/O/W）制备艾塞那肽纳米粒，与传统乳化法相比能解决药物向外水相泄露的问题，从而提高了水溶性药物的包封率［8］。本研究于2018 年10 月至2019 年8 月对纳米粒制备的处方工艺进行了优化完善，对制备的艾塞那肽进行含量检测并完成含量分析方法验证。通过体外表征和释放评价PLGA纳米粒（EX-PLGA NPs）的质量和缓释能力，说明了制备的PLGA 纳米粒用于艾塞那肽口服给药的可行性，为艾塞那肽抗糖尿病口服缓释制剂的分析和开发提供了实验基础。

1 材料与方法

1.1 试药与仪器

1.1.1 试药 醋酸艾塞那肽（EX，纯度＞98%，批号20181101，上海苏豪逸明制药有限公司）；聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA，乳酸/羟基乙酸=50∶50，分子量9 000，济南岱罡生工程有限公司）；聚乙烯醇（PVA，批号T20120310，国药集团化学试剂有限公司）；透析袋（分子量8 000～14 000，国药集团化学试剂有限公司）；其他试剂均为分析纯。

1.1.2 仪器 Waters 2695 型高效液相色谱仪（美国沃特世公司）；Waters 2996 PAD 检测器（美国沃特世公司）；Agilent® ZORBAX SB-C18 色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，美国Agilent 公司）；超声波细胞粉碎机（型号JY-150Y，上海熙扬仪器有限公司）；磁力搅拌器（型号78-1，上海助蓝仪器科技有限公司）；Zetasizer 激光粒径测定仪（英国Malvern 公司）；FEI Tecnai G2 F20 S-TWIN透射电镜（美国FEI公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 纳米粒的制备与处方工艺优化

1.2.1.1 制备方法 参考文献［9-11］及课题组前期研究方法，采用乳化复乳法制备艾塞那肽PLGA 纳米粒。称取3 mg 艾塞那肽溶解于0.2 mL 的水中，为内水相。称取一定量的PLGA 溶于0.8 mL 丙酮和二氯甲烷的混合溶液中（各50%），为油相。将内水相注入油相，在冰水浴条件下以95 W探头超声一定时间（超声1 s 间隔2 s），形成初乳。再迅速将初乳注入3 mL一定浓度的PVA水溶液中，在冰水浴条件下95 W 超声4 min（超声1 s间隔2 s），形成复乳。最后在磁力搅拌下将复乳缓慢滴入26 mL 的0.5% PVA外水相，在通风橱内以600 r/min 磁力搅拌使有机相完全挥发，得到带有乳光的纳米粒溶液。将纳米粒溶液离心，并用纯水重悬洗涤数次得纳米粒沉淀，收集沉淀冷冻干燥得固体艾塞那肽PLGA纳米粒。本研究前期通过单因素考察，固定了如下实验参数：艾塞那肽的量为3 mg，内水相量为0.2 mL。固定内水相∶油相=1∶4，采用丙酮和二氯甲烷为混合油相以增加包封率。冰水浴下间歇95 W 超声防止超声温度上升过快。复乳超声时间为4 min，复乳与外水相体积比为1∶6.5，外水相乳化剂PVA 浓度为0.5%，磁力搅拌转速600 r/min。确定了初乳超声时间为90～150 s；形成初乳中PVA 浓度范围为1%～5%；PLGA和艾塞那肽的比例范围为10～20。

1.2.1.2 包封率和载药量测定 精密称取一定量的EX-PLGA NPs 冻干粉末，按艾塞那肽含量测定步骤，取续滤液以高效液相色谱法（HPLC）测定样品中艾塞那肽含量。按以下公式计算EX-PLGA NPs 的载药量和包封率：载药量=m包/m总×100%，包封率=m 包/m 药×100%。式中：m 包为纳米粒中包入的艾塞那肽质量（mg），m 总为称取EX-PLGA NPs 的总质量（mg），m药为投入的艾塞那肽总质量（mg）。

1.2.1.3 Box-Behnken Design（BBD）响 应 面 优 化考虑到处方工艺的交互作用，选择初乳超声时间（A），形成初乳中PVA 浓度（B），PLGA 和艾塞那肽的比例（C）为考察对象，采用三因素三水平，以包封率为评价指标，选用BBD 响应面分析法对处方工艺进行优化［12］，设计因素水平见表1。

表1 BBD响应面优化设计三因素三水平

1.2.2 纳米粒的体外表征与释放

1.2.2.1 粒径和Zeta 电位测定 称取适量的EXPLGA NPs用纯化水分散稀释至合适的浓度，量取约1 mL 纳米粒溶液分别置于粒径池和电位池中，以激光粒径分析仪测定EX-PLGA NPs粒径和电位。

1.2.2.2 形态学考察 称取适量的EX-PLGA NPs用纯化水分散稀释至合适的浓度，吸取稀释后的样品溶液10 μL 置于铜网上，放置一定时间使样品溶液浸入铜网孔中，然后用滤纸吸走铜网上多余的溶液，室温干燥后于透射电子显微镜下观测EX-PLGA NPs形态并拍照。

1.2.2.3 纳米粒体外稳定性 将制备好的EX-PLGA NPs用纯化水分散，分别在0、24、48、72 h时测定其粒径和多分散性指数（PDI），考察其体外稳定性。

1.2.2.4 纳米粒体外释放 采用透析袋法评价EXPLGA NPs 在pH 6.8 磷酸缓冲盐溶液（PBS）中的体外释放行为［13］。称取一定量的EX-PLGA NPs 分散于1 mL 水中，置入透析袋中。同时称取与EXPLGA NPs 中艾塞那肽等量的艾塞那肽原料药溶于1 mL 的水中，置于透析袋中作为对照。每组做3 个平行实验，然后将透析袋完全浸入20 mL 的释放介质PBS 中，在37 ℃下恒温振荡（100 r/min）。在0.5、1、2、4、6、8、10、12、24、36、48、60、72 h 取样，取出来的样品过滤后取续滤液注入HPLC 测量释放介质中艾塞那肽的浓度，计算药物累积释放百分率。

1.2.3 艾塞那肽含量测定方法的建立 参考文献［14］艾塞那肽的分析检测方法，拟定如下HPLC 方法。流动相条件：pH 2.5 磷酸溶液-乙腈进行梯度洗脱；检测波长：220 nm；流速：1 mL/min；进样量：20 μL；柱温：30 ℃。梯度洗脱程序见表2。

表2 高效液相色谱法（HPLC）梯度洗脱程序

1.2.4 含量检测方法的方法学验证

1.2.4.1 专属性 将辅料PLGA 和PVA 溶解配制成空白辅料溶液。以初始比例流动相溶液为空白溶液，分别取空白溶液、艾塞那肽溶液、PLGA 溶液和PVA 溶液的续滤液进样，考察空白溶剂和辅料是否对艾塞那肽样品峰有干扰，考察样品峰理论塔板数，拖尾因子等指标。

1.2.4.2 溶液稳定性 称取艾塞那肽适量，用以初始流动相比例相当的乙腈，即45%乙腈溶解配制成浓度为0.08 g/L 的艾塞那肽溶液，过滤后取续滤液，分别于0、2、4、6、8、10、12 h 各进样1 次，记录峰面积，对艾塞那肽溶液进行12 h的稳定性考察。

1.2.4.3 标准曲线线性 以45%乙腈为溶剂，分别配制浓度为5、10、50、100、500 mg/L 的艾塞那肽溶液（n=2），取续滤液进样记录艾塞那肽峰面积，在此范围内考察其标准曲线线性。

1.2.4.4 回收率 配制3 份空白辅料溶液，每份取3个样品（n=3）备用。艾塞那肽标示量浓度为0.08 g/L，空白辅料溶液中各加入相当于标示量的80%、100%和120%的艾塞那肽，取续滤液进样记录艾塞那肽峰面积，根据标准曲线线性计算艾塞那肽回收率。

1.2.4.5 精密度 称取艾塞那肽原料药适量，用45%乙腈溶解配制成浓度为0.08 g/L 的溶液，过滤取续滤液进样，重复进样6 次考察进样精密度（n=6），隔天重复进样考察中间精密度（n=12）。

1.2.4.6 定量限 称取艾塞那肽原料药适量，用45%乙腈逐级稀释至信噪比为10左右时，溶液浓度确定为艾塞那肽的定量限。

1.2.5 艾塞那肽含量测定 测定方法：称取艾塞那肽PLGA 纳米粒适量，用10 mL 二氯甲烷充分溶解，用10 mL 纯化水进行萃取，萃取5 次合并萃取液至100 mL容量瓶中，加入45 mL乙腈，加入纯化水定容至刻度。配制成每1 毫升中约含0.08 mg 艾塞那肽的溶液，过滤后精密量取20 μL 续滤液注入液相色谱仪，记录艾塞那肽色谱图［15］。

另精密称取艾塞那肽原料药对照适量，用45%乙腈配制成每1 毫升中约含0.08 mg 艾塞那肽的溶液，同法精密量取20 μL 续滤液注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算艾塞那肽PLGA纳米粒中艾塞那肽含量。

1.3 统计学方法计量数值以± s 表示，采用SPPS 18.0软件进行多组间比较的单因素方差分析，采用Design-Expert 软件中的BOX-Benhnken 组合设计法对制备工艺进行优化。BBD 是响应面优化法中常用的试验设计方法，可有效减少试验次数，并可考察影响因素之间的交互作用，其优化求解出的最优工艺水平值不会超出最高值范围。对实验设计进行验证时，P＜0.05 视为模型差异有统计学意义，拟合精度好可进行后续优化；失拟误差P＞0.05差异无统计学意义，表明在整个回归区域内拟合良好；相关性系数R2越大相关性越好；变异系数（CV）＜5%，表明实验的可信度和精确度高［12］。

2 结果

2.1 BBD 响应面优化结果实验设计排列与包封率结果见表3，采用Design-Expert 软件对表3中实验数据进行二次多项式方程拟合，得到回归方程：

包封率（%）=72.40-1.48A+2.18B+3.35C+1.55AB+0.90AC-0.75BC-10.10A2-9.00B2-9.80C2。

拟合方程的R2为0.995 2，该拟合模型具有高度显著性（P＜0.05），该模型CV＝1.02%＜5%，校正系数R2Adj＝0.989 9，这说明预测的模型可以反映响应值为98.99%的变化，说明本实验设计的拟合程度良好，该拟合模型可以用于EX-PLGA NPs 的处方工艺优化分析和预测［16］。通过表4 可知，影响包封率最大的是投料比，其次是乳化剂浓度，最不显著的是超声时间，投料比与超声时间之间的交互影响最为显著。

表4 方差分析结果

使用Design-Expert 软件绘制A，B，C 三因素对指标包封率的三维响应面图，结果得到预测的最优处方工艺为：初乳超声时间为122 s，形成初乳中PVA 浓度为2.8%，PLGA 和艾塞那肽的投料比为14.9，预测包封率为72.40%。以最优处方工艺条件制备3 批EX-PLGA NPs，测 得包封 率为（73.43±0.59）%，实际包封率值和预测值相比偏差不超过5%，说明优化得到的最佳工艺处方条件可靠，预测性良好［16］。

2.2 纳米粒的体外表征与释放评价

2.2.1 粒径和Zeta 电位 测得EX-PLGA NPs 粒径为（157.2±3.1）nm，PDI 为0.164±0.008，粒径分布如图1所示，结果表明EX-PLGA NPs粒径分布均一，分散性良好。测得EX-PLGA NPs 表面Zeta 电位为（-19.5±2.6）mV，表面电位绝对值较大，通过相互排斥作用有利于EX-PLGA NPs在溶液中的稳定。

图1 聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米粒的粒径分布

2.2.2 艾塞那肽PLGA 纳米粒形态 EX-PLGA NPs透射电镜图显示，制得的EX-PLGA NPs 呈球形，表面规则圆整，粒径均一，分散性良好。

2.2.3 纳米粒体外稳定性 由EX-PLGA NPs 的体外稳定性实验结果可得，0、24、36、72 h 时EX-PLGA NPs 粒径分别为（157.2±2.1）nm、（157.5±2.6）nm、（158.6±3.1）nm 和（159.7±3.2）nm（F=0.72，P=0.067），说明制备的EX-PLGA NPs稳定性良好，无明显团聚现象。

2.2.4 纳米粒体外释放评价 从释放结果图可以看出，在6 h 时，艾塞那肽原料药累积释放已经高达95%，而EX-PLGA NPs 仅释放34%，且EX-PLGA NPs 持续释放至72 h 仅累积释放71%，说明制备的EX-PLGA NPs具有缓释效应，见图2。

图2 聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米粒（EX-PLGA NPs）体外释放

2.3 方法学验证结果

2.3.1 专属性 考察空白溶剂和空白辅料对艾塞那肽出峰有无干扰，见图3，空白溶剂无干扰，艾塞那肽峰与其他辅料峰分离良好，艾塞那肽峰理论塔板数11 693，拖尾因子1.017，峰形良好，专属性强。

表3 BBD响应面法的实验设计与包封率结果

2.3.2 溶液稳定性 由记录的艾塞那肽峰面积值计算得12 h 内峰面积的相对标准差（RSD）=0.69%，结果表明艾塞那肽溶液在12 h内是稳定的。

2.3.3 标准曲线线性 以艾塞那肽浓度（X）为横坐标，对应艾塞那肽峰面积（Y）为纵坐标，艾塞那肽溶液标准曲线结果表明艾塞那肽溶液浓度在5～500 mg/L 范围内与对应艾塞那肽峰面积呈线性关系，标准曲线方程为：Y=2 748.3X-11 330，相关性系数R2=0.999 9，得到曲线的线性良好。

2.3.4 回收率 根据艾塞那肽溶液线性标准曲线和回收率色谱图峰面积值计算，得艾塞那肽回收率结果：80%、80%、80%、100%、100%、100%、120%、120%、120%回收率分别为99.25%、98.87%、99.58%、99.36%、98.49%、99.83%、98.92%、100.07%、99.51%，平均回收率（n=9）为99.32%，在98%～102%内，回收率的RSD=0.50%，表明本方法准确度好。

2.3.5 精密度 重复6 次进样精密度RSD 值为0.49%，中间精密度（n=12）RSD=0.95%，皆＜2%，结果表明本方法的重复性与重现性良好。

2.3.6 定量限 在此液相条件下艾塞那肽溶液的定量限为0.23 mg/L，信噪比为10.13，符合要求。

总结，该艾塞那肽液相分析方法经过方法学验证，专属性强，线性范围宽，准确性和重复性好，分析方法科学可靠，可以作为艾塞那肽纳米粒中艾塞那肽含量测定方法［17］。

2.4 艾塞那肽含量测定测定以最优处方工艺条件制备的3 批次EX-PLGA NPs 中艾塞那肽含量，并计算其载药量和包封率结果如表5所示。

3 讨论

3.1 EX-PLGA NPs的制备与处方工艺优化报道中常见的PLGA 纳米粒制备方法有：沉淀法，乳化法和乳化复乳法。本研究前期曾用这3种方法分别制备EX-PLGA NPs，沉淀法制备的EX-PLGA NPs 放置约2 h 后烧杯底部出现部分沉淀，纳米粒溶液乳光消失；乳化法制备的EX-PLGA NPs 溶液呈乳白色且经过检测粒径较大；乳化复乳法制备的EX-PLGA NPs 溶液呈淡黄色乳光，放置一段时间后观察无沉淀且乳光依旧明显，故本研究选用了乳化复乳法作为纳米粒的制备方法。本研究前期使用了单因素法对各个处方工艺条件进行了优化，考虑到初乳超声时间，形成初乳中PVA 浓度，PLGA 和艾塞那肽的比例这3 个条件之间可能有交互作用，且优化后的条件已接近最优区域，故选用响应面法优化能快速找到最优条件。

表5 3批次EX-PLGA NPs测定结果

3.2 艾塞那肽含量测定方法为了确定检测波长，配制艾塞那肽溶液，PLGA 溶液和PVA 溶液，取续滤液注入色谱仪，开启PAD 检测器的全波长模式对各溶液进行全波长扫描。艾塞那肽溶液在190 nm 处有吸收峰，PLGA 溶液在245 nm 处有吸收峰，PVA 溶液在195 nm 处有吸收峰，经过吸收峰的比较，考虑到检测波长若太低会有很大的溶剂干扰峰，故其检测波长定为220 nm。洗脱程序选择了梯度洗脱是因为此前已使用等度洗脱进行了方法摸索，但艾塞那肽峰和铺料峰不能良好分离且峰形不好，拖尾因子较大。用梯度洗脱的方法能将各峰良好分离且峰形良好。

图3 空白溶剂、艾塞那肽、辅料聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）和辅料聚乙烯醇（PVA）色谱图：A为空白溶剂；B为艾塞那肽；C为PLGA；D为PVA

3.3 小结本研究以优化后工艺条件制备的EXPLGA NPs 粒径分布均匀，载药量和包封率高，稳定性好，具有缓释效果。建立了EX-PLGA NPs 中艾塞那肽含量的HPLC 分析方法，并完成了方法学验证，该方法专属性强，分析科学有效。本研究内容可为艾塞那肽抗糖尿病口服缓释制剂的开发提供研究和分析基础。在本研究基础上，下一步将对EXPLGA NPs在细胞水平及体内药效学进行探索，以证明EX-PLGA NPs口服治疗糖尿病的有效性。