张双明 ,梁雅楠 ,陈莉芝 ,徐文龙 ,祁居寿 ,杨 敏△

（1.甘肃农业大学理学院，甘肃 兰州 730070；2.甘肃临泽工业园区管理委员会凹凸棒石产业发展中心,甘肃 张掖 734200）

1 前言

牛乳中主要蛋白质为酪蛋白（Casein，CN）和乳清蛋白（Whey Protein，WP）。酪蛋白是一大类蛋白质的总称，由αs1-CN、αs2-CN、β-CN、κ-CN 4种单体组成，约占乳蛋白的80%。在乳中酪蛋白以胶束态存在，称为酪蛋白胶束（Casein micelles，CM）。酪蛋白胶束不仅性能优良、营养价值高，而且形态特殊，具有天然的多孔状特征，具有良好的吸附、包埋、脂肪结合等特性，可在蛋白类高端保健品中作为功能基料，用于负载营养成分[1]。

化学合成塑料制品因成本低廉、性质优良而被广泛用于食品包装和保鲜，但是使用后遗弃在环境中不易分解，造成严重的“白色污染”。随着人们对食品品质和保藏期要求的提高，以及环保意识的增强，迫切需要一种绿色、无污染、可降解的食品包装膜，以减小对生态环境的污染。因此，以天然可降解大分子为原料的可降解包装已成为食品包装领域的研究热点[2]。可降解包装膜制备常用原料为天然大分子化合物，如多糖、蛋白质。上述两种物质不仅来源广泛，而且安全无毒、可降解，还兼具一些生物活性，如营养补充和强化、抑菌等，是可降解包装膜制备的首选原料。以天然大分子为原料经过适宜的构建和复配，制备的可降解包装膜不仅性能优异，而且具备可食特性，备受研究者关注。

海藻酸钠是一种亲水性多糖，来源于褐藻，在食品工业常用作增稠剂、胶凝剂等。因天然无毒、可降解，海藻酸钠常作为优良的成膜基质。研究表明，添加量苹果多酚的海藻酸钠/κ-卡拉胶基复合可食膜不仅机械性能和阻隔性较高，而且具有抗氧化性，能有效抑制腰果仁的氧化酸败[3]。李慧等[4]用溶液共混法制备了海藻酸钠/羧甲基纤维素钠/明胶可食性包装膜，其性能优良。除了多糖，蛋白质也是常用的成膜基质，如大豆蛋白、酪蛋白、乳清蛋白、小麦蛋白、玉米醇溶蛋白、胶原蛋白等[5-7]。陈野等[8]用玉米醇溶蛋白成功制备了具有一定耐水性的可生物降解性膜。甘钊生等[9]用鱼鳞胶原蛋白制备了可食性复合膜，其对圣女果具有保鲜效果。Tien等[10]评价了酪蛋白钙和乳清蛋白的成膜性及其对苹果和马铃薯切片的保鲜效果，发现二者均可有效延缓切片的褐变。综上所述，多糖和蛋白质材料不仅具有优异的成膜性，而且具有一定的保鲜效果，是食品包装可降解及可食膜的首选基质。

本研究以海藻酸钠、酪蛋白为基材，通过优化二者配比，以及甘油、二氧化钛（TiO2）、凹凸棒土等用量，获得了酪蛋白/海藻酸钠可降解膜的制备工艺，并负载了姜黄素和花青素，评价了膜的溶解性、透光性和水蒸气透过率。研究结果可为蛋白质基可降解膜的制备提供参考依据。

2 材料与方法

2.1 材料与试剂

酪蛋白（化学纯）、姜黄素（分析纯）、花青素（分析纯）、海藻酸钠（分析纯）、TiO2（优级品），上海麦克林生化科技有限公司；甘油（分析纯），天津市光复科技发展有限公司；凹凸棒土，由甘肃临泽工业园区管理委员会凹凸棒石产业发展中心提供。其他试剂均为分析纯。

2.2 仪器与设备

微机控制电子拉力测试机（CMT2502），深圳市新三思计量技术有限公司；水蒸气透过率测试仪（PERME W3/030），济南兰光机电技术有限公司；电子分析天平（ME204E/02），梅特勒-托利多仪器有限公司；傅里叶红外光谱仪，美国赛默飞世尔科技；集热式恒温加热磁力搅拌器（DF-101S），郑州贝楷设备有限公司；电热鼓风干燥箱（DHG-9013A），上海一恒科学仪器有限公司；紫外-可见光分光光度计（TU-1901），北京普析通用仪器有限责任公司；高度分散均质机（AD500SH），上海昂尼仪器有限公司；离心机（H1850），长沙高新技术产业开发区湘仪离心机仪器有限公司。

2.3 膜制备工艺

配制4%的酪蛋白水溶液和1%的海藻酸钠水溶液，取适量酪蛋白溶液于100 mL烧杯中，加入适量海藻酸钠溶液，总体积为30 mL，加入适量甘油，置于45℃恒温水浴中加热搅拌20 min；向混合液中加入适量凸凹棒土，在转速为10 000 r/min下高速剪切1 min；再加入适量TiO2，在转速为15 000 r/min下高速剪切2.5 min；之后，加入适量氯化钙（CaCl2），于45℃的恒温水浴中加热并磁力搅拌10 min，获得涂膜液。将涂膜液注入铺有保鲜膜的表面皿中，平板延流，55 ℃下烘干4 h，小心揭下，即得酪蛋白/海藻酸钠膜。为评价膜对活性分子的负载性能，增加膜的抗氧化性和保鲜性能，以优化后的制备工艺为基础制备涂膜液，向其中加入适量姜黄素或花青素，磁力搅拌10 min，成膜，用以测定膜性能。

2.4 膜制备工艺优化

以拉伸强厚度和断裂伸长率为指标，选取酪蛋白与海藻酸钠的体积比、甘油用量、凹凸棒土用量、CaCl2用量、TiO2用量为变化因素，设置不同梯度，探究膜的机械强度，以获得最佳制备工艺。

2.4.1 CaCl2用量优化

以0.05 mol/L的CaCl2溶液为原料，设置0 μL、50 μL、100 μL、150 μL、200 μL为添加量梯度，按2.3的工艺流程制备膜，进行相关性能测试，确定最优结果。

2.4.2 甘油用量优化

分别设置甘油添加量1 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL、3.0 mL，按2.3的工艺流程制备膜，进行相关性能的测试，确定最优结果。

2.4.3 凸凹棒土用量优化

设置凹凸棒土添加量分别为0.00 g、0.15 g、0.30 g、0.45 g、0.60 g，按2.3的工艺流程制备膜，进行相关性能测试，确定最优结果。

2.4.4 酪蛋白与海藻酸钠配比优化

以4%的酪蛋白和1%的海藻酸钠溶液为原料，总体积设置为30 mL，分别设置二者体积比为30∶0、25∶5、20∶10、15∶15、10∶20、5∶25、0∶30，按2.3的工艺流程制备成酪蛋白膜，进行相关性能测试，确定最优结果。

2.4.5 TiO2用量优化

设置TiO2添加量为0.00 g、0.15 g、0.30 g、0.45 g、0.60 g，按2.3的工艺流程制备膜，进行相关性能测试，确定最优结果。

2.5 膜性能测试

2.5.1 机械性能测定

参照《塑料薄膜拉伸性能试验方法》（GB/T 1040—2006），检测薄膜的拉伸强度（TS）和断裂伸长率（EAB）。将膜裁切成2.1 cm×1.0 cm的长方形条状，将膜条的两端平整地夹在微机控制电子万能材料试验机的两个端口处，开启万能试验机开始测定，设置初始距离为30 mm，拉伸速度为300 mm/s。每种规格分别做3组平行。TS、EAB 计算公式分别为：

式中：F为膜断裂时承受的最大张力（N）；B为膜宽度（mm）；H为膜厚度（mm）；Lmax为膜断裂时的最大长度（mm）；L为膜的初始长度（mm）。

2.5.2 透光度测定

根据Ramos 等[11]的方法略有修改，采用紫外-可见分光光度计在600 nm 处测量膜的透光率（T）。以空白为对照，透光率间接表示膜的透明度，透光率值越大，表示透明度越高。将膜裁取3.0 cm×1.0 cm的长方形条状，用镊子将其贴于比色皿内壁，置于紫外-可见光分光光度计中进行测定，每个样品随机选取3个位置进行测量，取平均值。T的计算公式：

式中：T是膜的透光度（%）；ABS600是复合膜样品在600 nm处的吸光度值。

2.5.3 傅里叶变换红外光谱（FT-IR）扫描

采用傅里叶变换衰减全反射红外光谱（ATRFTIR）对所用的主要原料和膜进行扫描，以空气为空白背景，扫描次数为32，透射模式下对波数4 000～400 cm-1进行光谱扫描。

2.5.4 水溶性测定

将制得的膜裁切成3.0 cm×3.0 cm的长方形条状，取φ=10 cm的蒸发皿分别编号后，将裁切下来的膜条同时浸泡于10 mL的去离子水中。每隔5 min取上清液于离心管中，放入离心机中以转速10 000 r/min离心10 min。取离心上清液置于比色皿中，以去离子水作为参比溶液，采用紫外-可见光分光光度计进行全波长扫描，评价膜的溶解性。

2.5.5 水蒸气透过率

参考美国材料与试验协会制定的E 96-93标准[12]方法测定，采用水蒸气透过率测试仪（PERME W3/030）测定水蒸气透过率。将薄膜裁剪成适宜大小，放入试验杯中，并在其中加入定量的去离子水，然后置于实验湿度为90%、温度38 ℃的条件下，测试间隔30 min，每个试样做3组平行实验。水蒸气透过率计算公式为：

式中：WVP为试样的水蒸气透过率（g·mm）/（h·m2·kPa）；Δm为t时间内的质量增量（g）；d为膜的厚度（mm）；A为膜透过水蒸气的面积（m2）；t为测试时间间隔（h）；Δp为膜两侧的水蒸气压差（kPa），38 ℃下纯水的饱和蒸汽压为6.629 8 kPa。

2.6 数据分析与处理

采用Excel 2016 计算平均值及相对误差值，采用Origin 8.5 绘图软件绘图。

3 结果与分析

3.1 膜制备工艺优化

3.1.1 CaCl2用量优化

酪蛋白是钙离子敏感蛋白，添加CaCl2可在蛋白内部形成交联位点，促使酪蛋白形成致密网络结构[13]。另外，钙离子可交联海藻酸钠，使其凝胶。由图1（a）可知，CaCl2添加量对酪蛋白膜拉伸强度和断裂伸长率有显著影响。当CaCl2添加量为50 μL时，酪蛋白膜的断裂伸长率最高，当继续增加CaCl2至100 μL时，伸长率迅速下降，但拉伸强度达到最大值。李梦琴等[14]在研究小麦面筋蛋白可食性复合膜中发现，随着CaCl2浓度的增大，膜的拉伸强度先上升后下降，与本研究结果一致。添加一定量的CaCl2，在酪蛋白和海藻酸钠内部形成钙离子交联的网络结构，大分子链因交联而相互缠结，因此断裂伸长率迅速升高，拉升强度也显著增大。当继续添加CaCl2时，由于钙离子对酪蛋白和海藻酸钠的进一步交联，拉伸强度继续增加。然而，过度交联虽然使大分子网络结构更加稳定，但过多的交联位点使膜的韧性变差，刚性增强，因此伸长率降低。当CaCl2添加量超过100 μL后，膜的拉伸性能显著变差，甚至低于未添加CaCl2的膜，这是因为过量CaCl2使酪蛋白沉淀，因此机械性能降低。综上所述，选取CaCl250 μL为最优添加量。

图1（a） CaCl2用量对膜机械性能的影响

3.1.2 甘油用量优化

甘油添加量对膜性能的影响如图1（b）所示。由图可以看出，当甘油添加量为1 mL时，膜的机械性能最佳。随着甘油添加量的增加，膜的机械性能先降低后增加。单一的蛋白膜中，蛋白质分子键的作用是刚性的，膜较脆，往往需要添加增塑剂通过减少聚合物相邻链间的分子内相互作用[15]。增塑剂混溶在酪蛋白膜结构中，破坏了高分子间的结合，蛋白质分子间或分子内的相互作用减弱，软化了酪蛋白膜的刚性结构，使得膜有效地延展和松弛[16]。当甘油量过少时，酪蛋白膜极易干裂，塑性较差，因此无法测出拉伸强度和断裂伸长率（图中未给出空白对照组数据）。当甘油量过多时，甘油填充在酪蛋白和海藻酸钠分子间，阻碍了致密网络结构的形成，原料凝胶性变差，因此膜的机械性能变差。冉锐敏等[17]在大豆分离蛋白膜结构与配方优化研究中发现，随着甘油添加量的增加，大豆分离蛋白膜的拉伸强度降低。综上所述，甘油的最优添加量为1.0 mL。

图1（b） 甘油用量对膜机械性能的影响

3.1.3 凸凹棒土用量优化

凹凸棒土添加量对酪蛋白膜的机械性能影响如图1（c）所示。由图可以看出，与未添加凹凸棒土的膜相比，添加量为0.15 g时膜的拉伸强度显著增加。凹凸棒比表面积大，表面活性高，含有极性的羟基，可以与蛋白质和多糖形成氢键[18]，因此，具有加固膜网络结构的作用，使其拉伸强度增加。但是，膜内部网络结构越致密，其韧性越差，因此添加凹凸棒土后，膜的断裂伸长率降低。综上所述，选择凹凸棒土添加量为0.15 g为最佳参数。

图1（c） 凹凸棒土用量对膜机械性能的影响

3.1.4 酪蛋白与海藻酸钠配比优化

海藻酸钠和酪蛋白比例对膜机械性能的影响如图1（d）所示。由图可以看出，未添加海藻酸钠的酪蛋白膜具有一定的拉伸强度，说明酪蛋白具有一定的成膜性，但膜的机械强度较差。当海藻酸钠与酪蛋白体积比为5∶25时，膜的拉伸强度和断裂伸长率显著增大。之后，随着酪蛋白比例的降低，膜的机械性能基本呈线性降低。王岱[19]在可食性海藻酸钠/淀粉薄膜的制备与性能研究中发现，随着海藻酸钠溶液质量分数的增加，膜抗拉强度逐渐增大，在质量分数达到3%后增加不明显；断裂伸长率随着质量分数的增加出现先增大后减小的趋势，与本研究结果基本一致。海藻酸钠具有较高的黏度，与酪蛋白混合后，可形成填充型复合物；加上钙离子的交联作用，二者形成较为致密又柔软的网络结构，表现出优异的成膜性和机械强度[20]。当海藻酸钠比例继续增加时，在钙离子作用下海藻酸钠形成凝胶，成膜性变差，膜的机械强度降低。由此可见，海藻酸钠和酪蛋白比例为5∶25时膜性能最佳。

图1（d） 酪蛋白和海藻酸钠配比对膜机械性能的影响

3.1.5 TiO2用量优化

大分子可食膜中添加纳米填充物能够提高其机械、热力学和阻隔等性能[21-23]。另外，由于TiO2具有光催化活性，在紫外光辐射的条件下具有抑菌功能[24]。为了进一步提升膜的机械强度，添加适量TiO2，其添加量对膜机械性能的影响如图1（e）所示。添加0.20 g TiO2后，膜的拉伸强度和断裂伸长率显著增加，这是由于TiO2分散于膜网络结构中，起到固定网络结构的作用，能够显著提高膜对外界应力的抵抗能力。另一方面，膜的断裂伸长率随着TiO2添加量的提高而显著降低，这表明TiO2的加入降低了膜的韧性。因此，选择添加0.20 gTiO2为最优参数。

图1（e） TiO2用量对酪蛋白膜机械性能的影响

3.2 最优工艺下膜的机械强度与伸长位移

优化指标在最佳条件下膜的拉伸曲线如图2所示。由图可以看出，每次优化对于膜的机械性能都有较明显的改善。添加甘油后，膜拉伸位移得到了提高，但韧性不足，原因是甘油软化了酪蛋白膜刚性结构的同时破坏了蛋白分子间及其与其他各物质之间的相互作用。添加一定量的凹凸棒土之后，膜的机械性能明显得到了提升。经过海藻酸钠和酪蛋白配比的优化，同时有效提升了膜拉伸位移和韧性。最后，添加一定量的TiO2再次显著提升了膜的韧性。最佳工艺下制备的膜具有一定的机械强度和韧性，可用于食品包装和保鲜。

图2 膜机械强度与伸长位移

3.3 膜的透光度分析

对于膜研究中，透光度是一个衡量其性能的重要参数。在食品包装中，包装膜的透光情况是消费者对于产品好坏的第一感觉指标。从图3可以看出，整体来说该酪蛋白/海藻酸钠可溶解膜具有很好的防透光性能，CaCl2作为交联剂使得蛋白分子间或与其他各物质之间的结合更为紧密；甘油在软化了酪蛋白膜刚性结构的同时，破坏了蛋白分子间或与其他各物质之间的结合，使得透光度增强；凹凸棒土具有独特的三维空间链式结构及特殊的针、棒状晶体结构，因而有不同寻常的吸附性能，引起了透光率增大；海藻酸钠具有增稠剂的效果，当其与Ca2+共存时，可以大大提高海藻酸钠的黏度，项本平和陈亚萍[25]在氧化淀粉的黏度与透光率关系的研究中发现黏度与透光率成反比关系，故此时的透光度减弱；TiO2纳米颗粒是一种惰性的、无毒的氧化物，并被证实具有吸收可见光的性能，已被用于功能性食品的开发。它的加入使得透光率进一步下降。

图3 膜的透光度

3.4 傅里叶红外变换分析

图4为原料和负载花青素5 mL、负载姜黄素5 mL的膜红外谱图。胶束态酪蛋白在3 301 cm-1处存在-OH伸缩振动峰；1 640 cm-1对应C=O伸缩振动峰，即酰胺Ⅰ带；1 480～1 200 cm-1区间对应C-H及N-H振动以及酰胺结构的异构体，其是蛋白质的指纹区。海藻酸钠在1 600 cm-1处为-COO-羟基盐的反对称伸缩振动峰，在1 500～1 250 cm-1为-OH的面内弯曲振动，在1 070 cm-1为C-O-C拉伸峰。由于凹凸棒土晶体的每单元层间通过氧连接成孔道式结构使凹凸棒土具有强吸附性，其不仅吸附Cu2+、Pb2+等阳离子或大分子、极性有机分子,还可吸附润滑油脂、醇、醛、芳香烃链等大分子或细菌、霉块等物质[26]，故图4中凹凸棒土的红外峰有可能是制备过程中所吸附的有机物质所致。负载花青素5 mL、负载姜黄素5 mL的膜红外谱图具有相似特征，其中包含了原料物质的主要特征峰，但精细化结构出现了差异，这有可能与各个原料之间发生了一些分子间的化学反应有关，从而出现了差异。相比较之下，负载花青素5 mL、负载姜黄素5 mL的膜红外谱图也存在差异，这与其所负载的物质不同有关。

图4 膜的傅里叶红外变换光谱

3.4 膜的水溶性分析

将负载原花青素和姜黄素的膜进行水溶性分析，结果如图5所示。由图可以看出，两种膜均具有较好的水溶性，浸入水中5 min开始迅速溶解，在30 min溶解完全。另外，与姜黄素相比，原花青素在280 nm附近具有较强吸收，因此随着溶解的进行，该处吸收强度逐渐增大，说明原花青素和姜黄素被均匀负载于膜内部，证实了涂膜液具有较好的成膜性，且成膜后原料中各物质分布均匀。

图5（a） 负载原花青素膜的水溶性曲线

图5（b) 负载原姜黄素膜的水溶性曲线

作为食品保鲜涂覆材料，需具有优异的成膜性，涂覆后可在食品表面形成保护膜，防止食品被环境中的微生物侵染而腐败变质。另一方面，涂覆的膜需具有优良的可洗性能，即食用时可迅速将膜冲洗掉，不影响食品的外观和口感。本研究制备的膜不但具有较好的成膜性，膜的机械强度也能使其抵抗一定程度的外界拉伸，而且膜易溶于水，即使浸泡于水中，5～15 min即可完全脱落。

3.5 膜的水蒸气透过率分析

食品包装的阻隔性是影响包装对食品保护性能优劣的重要因素，不同的食品对其包装的阻隔性要求也是不同的。食品包装的阻隔性一方面保证外部环境中的各种细菌、尘埃、光、气体、水分等不能进入包装内的食品中，另一方面是保证食品中所含的水分、油脂、芳香成分等，对食品质量必不可少的成分不向外渗透，从而达到保证食品不变质的目的[27]。按2.5.5 的实验方法及数据处理方式可得该膜在负载花青素和姜黄素时水蒸气透过率分别为2.59（g·mm）/（h·m2·kPa）和2.66（g·mm）/（h·m2·kPa）。李梦琴在小麦面筋蛋白可食性复合膜的改性研究中所制得的膜水蒸气透过率为0.503（g·mm）/（h·m2·kPa），通过对比发现其实验主要材料为小麦面筋蛋白（谷朊粉）、大豆分离蛋白、氯化钙、乙醇、甘油。由于麦谷蛋白具有弹性，麦醇蛋白具有延伸性，能与水形成网络结构，从而具有优良的黏弹性、延伸性、吸水性、乳化性、成膜性等独特的性能，故使其水蒸气透过率较低。辛颖等[28]在酶法制备乳清蛋白可食性膜工艺的研究中所制得的膜水蒸气透过率为1.21（g·mm）/（h·m2·kPa），其主要实验材料为采用转谷氨酰胺酶改性的乳清蛋白，由于转谷胺酰胺酶（Transglutaminase，TG）是一种催化蛋白质分子间或分子内形成ε-（γ-谷氨酰基）赖氨酸共价键的酶，广泛用于交联酪蛋白、乳球蛋白、大豆蛋白、小麦麦谷蛋白等不同食品蛋白质，有助于蛋白质产生自我支持的网络结构，增强成膜性能，故其水蒸气透过率较低[29]。赵晓彤等[30]在超声辅助提高大豆蛋白纳米复合膜包装性能研究及保鲜应用中所制得的膜水蒸气透过率为6.22（g·mm）/（h·m2·kPa），其主要材料为大豆分离蛋白、聚乙烯醇、纳米纤维素，由于材料差异，膜的水蒸气透过率与本文实验结果具有一定差异。

4 结论

以拉伸强度和断裂伸长率为指标，通过优化获得酪蛋白/海藻酸钠膜的最佳制备工艺为CaCl2（浓度为0.05 mol/L）用量50 μL、甘油用量1 mL、凹凸棒土用量0.15 g、酪蛋白与海藻酸钠体积比5∶25、TiO2用量0.20 g。在最佳工艺下，膜的机械性能优良，具有较好的水溶性，可用于食品包装和保鲜。