魏艳芸,王月玲，王 蕙

（兰州市食品药品检验检测研究院，甘肃 兰州 730050）

桂附地黄丸（浓缩丸）由熟地黄、附子、肉桂、泽泻、山药、山茱萸、茯苓及牡丹皮等八味药组成，该处方是由汉代张仲景《金匮要略》加减而来，具有温补肾阳之功效，全方温而不燥，补而不腻，故得到极为广泛的应用。现代医学研究表明，桂附地黄丸具有改善肾功能、增强免疫力、预防肿瘤、抗突变、延缓衰老及对抗活性自由基的作用，还有降血糖及改善胰岛素耐受性、改善高脂血症，升高高密度脂蛋白、促进造血功能恢复、改善微循环、降血压、促进性激素分泌，预防电离辐射损伤等作用[1-6]。其中，该方以熟地黄滋阴补血，填精补髓为主药。熟地黄是玄参科植物地黄（Rehmannia Glutinosa Libosch）新鲜或者干燥块根经过蒸制或者酒炖而来，味属甘，性微温；归肝；滋阴补血,益精填髓，用于贫血，月经不调,崩漏下血，肝肾阴虚，腰膝酸软，盗汗遗精，晕厥，耳鸣，须发早白之效，熟地黄被冠为“壮水之主，补血之君”“补精之王”等称号[7-10]。

目前，国内有关桂附地黄其他剂型的制剂的质量标准研究均已比较完善[11-12]，而桂附地黄丸（浓缩丸）的质量标准相对滞后，其现行标准自1993年收入卫生部药品标准中药成方制剂第八册以来，再未进行过任何修订，标准正文项下考察了性状、鉴别和含量测定3个项目，鉴别项下仅对粉末入药的牡丹皮、附子（制）、肉桂、山药进行了显微鉴别，对浸膏入药的主药熟地黄无任何鉴别方法。

为保证药品质量，患者安全用药，确保药物疗效，本研究以熟地黄对照药材为参照标准，通过考察各薄层色谱影响条件，旨在建立一种熟地黄的薄层色谱鉴别方法，为桂附地黄丸（浓缩丸）的质量评价提供参考。

1 材料

1.1 试剂与仪器

硅胶G板（青岛海洋化工厂）规格：10 cm×10 cm，厚度0.2～0.25 mm；10 cm×20 cm，厚度0.2～0.25 mm；硅胶GF254板（青岛海洋化工厂）规格：10 cm×10 cm，厚度0.2～0.25 mm；层析缸（上海信谊仪器厂）；数显干燥箱（DHG-90708）；薄层半自动（点样）成像系统（Visualizer/linomat5）；超声波清洗机（SB25-12DT）；数控恒温水浴锅（SCG-2）；试剂均为分析纯。

1.2 对照药材

熟地黄对照药材，中国食品药品检定研究院，批号：121196-202007，规格1 g。

1.3 供试品

桂附地黄丸（浓缩丸），各批次样品信息见表1。

表1 桂附地黄丸（浓缩丸）各批次样品信息

续表1

2 方法与结果

2.1 薄层色谱条件优化

2.1.1 供试品溶液制备方法考察

用以下3种方法制备供试品溶液，在不同色谱条件下进行展开。

方法（1）：称取本品2.5 g，研细，加100 mL水，温热使之充分溶散，再加热至沸腾，冷却，用脱脂棉进行滤过，取滤液，滤液用乙酸乙酯提取2次，每次30 mL，合并乙酸乙酯液，水浴蒸干，残渣加甲醇1 mL使之充分溶解，即得。

方法（2）：称取本品2.5 g，研细，加20 mL乙醇，冷浸24 h，滤纸滤过，滤液水浴浓缩至1 mL，即得。

方法（3）：称取本品2.5 g，研细，加80%甲醇溶液50 mL，超声处理30 min，滤过，滤液水浴蒸干，残渣中加入5 mL水使之溶解，再用水饱和正丁醇溶液振荡提取4次，每次10 mL，合并正丁醇液，水浴蒸干，残渣加甲醇1 mL使之充分溶解，即得。

通过不同展开剂展开，不同条件显色比较，结果显示，以方法（1）制备的供试品溶液，在薄层色谱图中主成分斑点清晰，与对照药材溶液显现的斑点较为一致，且分离效果好；以方法（2）、（3）制备的供试品溶液显现斑点较少。故选择方法（1）进行供试品溶液制备，见图1。

2.1.2 对照药材溶液制备

称取熟地黄对照药材2 g，加乙醇20 mL，冷浸24 h，滤过，滤液水浴蒸干，残渣加1 mL甲醇溶液使之溶解，作为对照药材溶液。

2.1.3 阴性对照溶液制备

按照桂附地黄丸（浓缩丸）的处方比例，称取缺熟地黄的各味药材，模拟处方制得缺少熟地黄的阴性对照样品（称取泽泻、茯苓各2.22 g研碎成粗粉，过2号筛，加水20 mL煎煮两次，每次煎煮时间2 h，合并煎液，过滤，滤液合并，浓缩；称取山茱萸2.96 g、牡丹皮2.22 g，用70%乙醇为溶剂浸渍24 h，回收乙醇，再浓缩，称取剩余药物肉桂0.74 g、附子0.74 g、山药2.96 g粉碎成细粉，与上述各浓缩液混合均匀，即得）。然后再按照供试品溶液制备方法（1）制成阴性对照溶液。

2.1.4 展开系统考察

选择4种展开系统，分别点样，进行薄层色谱条件考察：①硅胶G板，以二甲苯-乙酸乙酯（1∶1）为展开剂；②硅胶G板，以石油醚（60 ℃～90 ℃）-乙酸乙酯（1∶1）为展开剂；③硅胶G板，以三氯甲烷-甲醇（12∶1）为展开剂；④硅胶GF254板，以石油醚（60 ℃～90 ℃）-乙酸乙酯（1∶1）为展开剂。

通过在不同条件下显色，结果显示，以二甲苯-乙酸乙酯（1∶1）或三氯甲烷-甲醇（12∶1）为展开剂时，各主斑点比移值较小，不能做到斑点有效分离；以石油醚（60 ℃～90 ℃）-乙酸乙酯（1∶1）为展开剂，在硅胶G板或硅胶GF254板上展开时，各主斑点显色清晰，展开距离适中，分离效果好。故选择以石油醚（60 ℃～90 ℃）-乙酸乙酯（1∶1）为展开剂，见图1。

2.1.5 显色方法及检视条件考察

选择三种显色方法，对不同展开条件的薄层板显色观察：①晾干，喷以2,4-二硝基苯肼乙醇试液，日光下检视；②晾干，喷以二硝基苯肼试液，在105 ℃加热至斑点显色清晰，日光下检视；③晾干，喷以2%硫酸香草醛，在105 ℃加热至斑点显色清晰，日光灯下检视；④在紫外光（254 nm）下检视。

结果显示，以二硝基苯肼试液为显色剂，各主斑点显色良好，而在105 ℃加热后，各斑点显色更为清晰；以2%硫酸香草醛为显色剂时，对照主斑点不能良好显色；在254 nm紫外灯下检视时，对照主斑点亦显色不清晰。故选择喷以二硝基苯肼试液为显色剂，在105 ℃加热至斑点显色清晰，日光下检视，见图1。

图1 桂附地黄丸（浓缩丸）中熟地黄薄层鉴别色谱条件优化图谱

利用不同展开系统及不同显色方法，对各供试品溶液照薄层色谱法试验。取供试品溶液、对照药材溶液及阴性对照溶液分别点于同一硅胶G板上，以二甲苯-乙酸乙酯（1:1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2，4-二硝基苯肼乙醇试液，日光下检视（见图1 1A）；取供试品溶液、对照药材溶液及阴性对照溶液分别点于同一硅胶G板上，以二甲苯-乙酸乙酯（1∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以二硝基苯肼试液，在105℃加热至斑点显色清晰，日光下检视（见图1 1B）；取供试品溶液、对照药材溶液及阴性对照溶液分别点于同一硅胶G板上，以二甲苯-乙酸乙酯（1∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2%硫酸香草醛试液，在105℃加热至斑点显色清晰，日光下检视（见图1 1C）；取供试品溶液、对照药材溶液及阴性对照溶液分别点于同一硅胶G板上，以石油醚（60 ℃～90 ℃）-乙酸乙酯（1∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2，4-二硝基苯肼乙醇试液，日光下检视（见图1 2A）；取供试品溶液、对照药材溶液及阴性对照溶液分别点于同一硅胶G板上，以石油醚（60 ℃～90 ℃）-乙酸乙酯（1∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以二硝基苯肼试液，在105℃加热至斑点显色清晰，日光下检视（见图1 2B）；取供试品溶液、对照药材溶液及阴性对照溶液分别点于同一硅胶G板上，以石油醚（60 ℃～90 ℃）-乙酸乙酯（1∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2%硫酸香草醛试液，在105℃加热至斑点显色清晰，日光下检视（见图1 2C）；取供试品溶液、对照药材溶液及阴性对照溶液分别点于同一硅胶G板上，以三氯甲烷-甲醇（12∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2，4-二硝基苯肼乙醇试液，日光下检视（见图1 3A）；取供试品溶液、对照药材溶液及阴性对照溶液分别点于同一硅胶G板上，以三氯甲烷-甲醇（12∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以二硝基苯肼试液，在105℃加热至斑点显色清晰，日光下检视（见图1 3B）；取供试品溶液、对照药材溶液及阴性对照溶液分别点于同一硅胶G板上，以三氯甲烷-甲醇（12∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2%硫酸香草醛试液，在105℃加热至斑点显色清晰，日光下检视（见图1 3C）；取供试品溶液、对照药材溶液及阴性对照溶液分别点于同一硅胶GF254板上，以石油醚（60 ℃～90 ℃）-乙酸乙酯（1∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，在紫外光（254 nm）下检视（见图1 4D）。

通过不同供试品溶液制备方法考察、不同展开系统以及不同显色方法考察，上述图谱中，2B图谱显示最优。确定采用方法（1）制备供试品溶液，在硅胶G板上，以石油醚（60 ℃～90 ℃）-乙酸乙酯（1∶1）为展开剂展开，喷以二硝基苯肼试液，在105 ℃下加热至斑点明显呈现，日光下检视，所得熟地黄薄层色谱分离效果和显色效果较佳，斑点清晰，且阴性对照无干扰，为最优薄层色谱条件。

2.1.6 点样量考察

吸取供试品溶液各1 μL、2 μL、5 μL、10 μL、20 μL点于同一张硅胶G薄层板上，以石油醚（60 ℃～90 ℃）-乙酸乙酯（1∶1）为展开剂展开，喷以二硝基苯肼试液，在105 ℃下加热至斑点明显呈现，日光下检视。结果发现，点样量为5 μL时，斑点清晰，分离效果好，1 μL、2 μL的斑点含量过低成像不清晰，10 μL、20 μL的斑点有明显拖尾现象。故选择点样量为5 μL，见图2。

图2 点样量考察薄层色谱图

2.2 方法验证

2.2.1 专属性及精密度考察

分别吸取供试品溶液、对照药材溶液及阴性对照溶液各5 μL点于硅胶G薄层板上，供试品溶液重复点样6次，以石油醚（60 ℃～90 ℃）-乙酸乙酯（1∶1）为展开剂展开，喷以二硝基苯肼试液，在105 ℃下加热至斑点明显呈现，日光下检视。结果表明，供试品中比移值（Rf）为0.41的棕黄色条带和Rf为0.59的黄色条带所呈现的颜色和位置与熟地黄对照药材条带一致，且阴性对照在主斑点位置处无干扰，表明该方法专属性良好。同一供试品溶液重复点样后，各斑点清晰，条带颜色和位置一致，精密度良好，见图3。

图3 精密度考察薄层色谱图

2.2.2 样品验证试验

对11批不同厂家、批号的桂附地黄丸（浓缩丸）采用方法（1）分别制备供试品溶液，各吸取5 μL点于同一硅胶G板上，以石油醚（60 ℃～90 ℃）-乙酸乙酯（1∶1）为展开剂展开，喷以二硝基苯肼试液，在105℃下加热至斑点明显呈现，日光下检视。结果发现供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，斑点清晰，阴性对照无干扰，且分离效果和显色效果均良好，见图4。

图4 不同批号样品薄层色谱图

3 结语

随着人们生活方式的变化，肾阳疾病已经开始年轻化，而桂附地黄丸也是治疗该类疾病的首选药物之一，因此有必要加大对此品种的质量控制，以保证产品安全有效，为临床安全用药提供保障，为药品监管提供技术支撑。而桂附地黄丸（浓缩丸）因剂型服用方便，使用广泛，其质量评价尤为重要，本研究选择药方中君药熟地黄，作为其质量控制的重要指标，对其真伪进行薄层鉴别。

对于桂附地黄丸（浓缩丸）中的熟地黄的鉴别，本研究对其薄层鉴别条件进行了详细的考察，以熟地黄对照药材为对照，在色谱系统中考察不同提取溶剂（乙酸乙酯，乙醇，水饱和正丁醇溶液），不同展开剂（二甲苯-乙酸乙酯，石油醚（60 ℃～90 ℃）-乙酸乙酯，三氯甲烷-甲醇），不同显色剂（2,4-二硝基苯肼乙醇试液，二硝基苯肼试液，2%硫酸香草醛试液），各点样量（1 μL，2 μL，5 μL，10 μL，20 μL），及不同的检视条件（日光下，105 ℃条件下加热后日光下，紫外光（254 nm）下）对薄层色谱分析的影响，从而确定供试品溶液制备方法和最佳薄层色谱检测条件，并在薄层色谱鉴别的方法学验证中对其专属性及精密度进行了考察及样品验证，最终确定薄层鉴别分析方法为采用乙酸乙酯提取样品，在薄层色谱硅胶G板上，以石油醚（60 ℃～90 ℃）-乙酸乙酯（1∶1）为展开剂展开，喷以二硝基苯肼试液，在105 ℃下加热至斑点明显呈现，日光下检视，所得熟地黄薄层色谱分离效果和显色效果较佳，斑点清晰、专属性强、重现性好，且阴性对照无干扰。

综上所述，本研究所建立的薄层色谱鉴别方法操作简便易行，定性特征明显、结果直观，可有效鉴别桂附地黄丸（浓缩丸）中的熟地黄，可为桂附地黄丸（浓缩丸）的质量评价提供一定参考。