梅汝蕃，林小雨，孙通宝，潘素敏，陈丽凤，张华英，王秋悦

(1. 河北科技师范学院动物科技学院 河北省预防兽医重点实验室，河北 秦皇岛 063000 ； 2. 河北省沙河市第一中学，河北 沙河 054100)

人五毛滴虫是一种人兽共患寄生虫，主要在人、犬、猫、灵长类和啮齿类动物的消化道内寄生[1]。过去通常认为人五毛滴虫是宿主肠道内共生生物，但是近些年国内外陆续出现从腹泻动物体内分离到人五毛滴虫的报道[2]，另有报道表明其可引起人类腹泻、肺部感染、类风湿关节炎等[3]。人五毛滴虫可能为一种新发的传染性疾病病原，具有人兽共患和水源传播的潜力，其公共卫生学意义重大。然而，虽然已经认识到人五毛滴虫作为哺乳动物病原体的潜在危险，但目前关于中国野生动物的人五毛滴虫流行病学调查研究较少。因此，本试验主要对河北省某野生动物园园养野生动物进行人五毛滴虫的感染情况调查，以更好地确定人和动物感染的风险和动态。

1 材料与方法

1.1 样品采集 2019年12月—2020年4月从河北省某野生动物园收集了88份动物粪便样品，共包含32种动物，其中草食动物70份(表1)，肉食动物18份(表2)。

1.2 主要材料 粪便基因组DNA提取试剂盒，购自北京索莱宝科技有限公司；DL2 000 DNA Marker、dNTP Mix和Loading Buffer，均购自天根生化科技(北京)有限公司。

1.3 形态结构观察

1.3.1 直接涂片法 在洁净的载玻片中央置1滴生理盐水，用牙签挑取米粒大小的粪便，在生理盐水中涂抹均匀，去掉多余残渣，盖上盖玻片，用吸水纸将多余水分吸掉，置于光学显微镜下观察。首先通过形态学对粪便进行初步筛选，收集并培养含有疑似毛滴虫的样品。

1.3.2 碘液染色法 置1滴碘液在载玻片上，用牙签挑取少许粪便涂匀在碘液中，除去多余残渣，最后加盖玻片，置光学显微镜下观察。

1.4 粪便基因组的提取及PCR检测 使用粪便基因组DNA提取试剂盒提取粪便样品DNA，-20 ℃保存备用。根据GenBank中登录的人五毛滴虫18S rRNA基因序列(KX136894)设计引物，引物序列为RWMDC18S-F：5′-TGTAAACGATGCCGACAG-AG-3′，RWMDC18S-R：5′-CAACACTGAAGCCAATG-CGAGC-3′。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。反应体系(20 μL)：2×EsTaqMaster Mix(Dye)10.0 μL，DNA模板1.0 μL，上、下游引物各0.5 μL，加ddH2O至20 μL。PCR反应条件：94 ℃ 1 min，61 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共35个循环；72 ℃延伸10 min。将PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.5 人五毛滴虫18S rRNA基因序列同源性及遗传进化分析 将PCR阳性产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，将测序结果与GenBank中登录的人五毛滴虫18S rRNA序列进行同源性分析；利用MEGA 7.0构建人五毛滴虫18S rRNA基因的系统发育进化树。

2 结果

2.1 形态结构观察 直接涂片法结果如图1A、1B所示，在低倍镜下可观察到大量快速游动的虫体，高倍镜下可见虫体呈半透明卵圆形或梨形。当虫体活性良好时做原地旋转运动，或呈螺旋状前进，游动迅速；当培养基营养被大量繁殖的虫体过度消耗时，虫体活性减弱，镜下可观察到虫体游动明显减慢或停止，形状近似变为圆形。碘液染色法结果如图1C所示，能清晰地看到虫体鞭毛结构，有时可见波状膜。从镜检结果可初步判定虫体为毛滴虫，且虫体活性较强。

图1 毛滴虫显微镜观察

2.2 人五毛滴虫18S rRNA的PCR扩增 经PCR检测，88份粪便样品中人五毛滴虫18S rRNA基因阳性样本共5份，总阳性率为5.7%。其中，70份草食动物(共15种)样品中检测出毛滴虫3份，阳性率为4.3%(表1)；18份肉食动物(共7种)样品中检测出毛滴虫2份，阳性率为11.1%(表2)。

表1 草食动物人五毛滴虫感染情况

表2 肉食动物人五毛滴虫感染情况

2.3 毛滴虫18S rRNA基因序列同源性及遗传进化分析 将PCR扩增的5份阳性样品基于18S rRNA基因测序后所获得的序列，通过NCBI的BLAST检索系统进行比对，构建系统进化树，如图2所示，5份阳性样品(命名为TSMDC 1～TSMDC 5)18S rRNA基因与GenBank中登录的人五毛滴虫基因序列MH997492、MH997493、MF991102、KX833161、KM205213、KJ404269和KX136886处于同一分支，且相似性高达99%，因此本试验在野生动物体内检测到的虫体确定为人五毛滴虫。该进化分支中选用的人五毛滴虫基因分别来源于动物猪、山羊、犬类、猕猴等，说明人五毛滴虫感染动物种类的多样性，草食动物和肉食动物均可感染人五毛滴虫。本试验所测得序列TSMDC 1～TSMDC 5均发生了轻微的等位基因突变，第96位碱基发生变化(C96T)。

图2 基于人五毛滴虫18S rRNA序列同源性构建的系统发育进化树

3 讨论

近些年出现了越来越多的关于人五毛滴虫感染动物的报道，包括猪、羊、牛、犬、猫、非人灵长类、啮齿类等动物，说明人五毛滴虫宿主范围明显在不断扩大。Dimasuay等发现，蟒蛇、角鸮、山羊均可作为人五毛滴虫的感染宿主[4]。2014年Li等首次报道猪为人五毛滴虫的新宿主[5]。Li等在水牛和黄牛体内分离到人五毛滴虫虫株[6]。董兵等从东北的鹿肠道内分离到人五毛滴虫，而且感染率高达50%(34/68)[7]。王秋悦等从腹泻貉子体内分离得到人五毛滴虫[8]。而且也有从人体分离到人五毛滴虫虫株的报道[9]。最新的研究发现，在癌症患者中人五毛滴虫感染率明显多于健康人群，而且人五毛滴虫导致胃肠道发生肿瘤的风险增加了6.75倍[10]。人五毛滴虫已成为人兽共患寄生虫病的潜在重要病原体，且其具有较强的新宿主适应力。相信随着研究的深入，会发现越来越多的人五毛滴虫新宿主。

本试验对河北省某野生动物园园养野生动物中人五毛滴虫的感染情况进行了调查。结果显示，该野生动物园中野生动物存在人五毛滴虫感染，草食动物感染率为4.3%，肉食动物感染率为11.1%，肉食动物的感染率要高于草食动物。总体来说，该园野生动物人五毛滴虫感染率不高，主要是由于该动物园管理较为规范，且定期进行驱虫。根据我国的文献报道，人五毛滴虫在不同地区的不同物种中的感染率都不尽相同。Li等调查了吉林省野生动物(包括梅花鹿、獭兔、蓝狐、银狐、浣熊狗和水貂等动物)的人五毛滴虫感染情况，感染率介于16.25%～53.33%，感染率最高的为浣熊狗[11]。Li等对中国中东部地区绵羊和山羊进行了人五毛滴虫流行病学调查，发现感染率分别为6.0%和0.3%[12]。柳佳等对河北省毛皮动物貉子体内人五毛滴虫的感染情况进行了初步调查，发现腹泻貉子中有30%以上均有人五毛滴虫的感染[13]。

本试验发现，该动物园中的梅花鹿、黇鹿、驴和长臂猿存在人五毛滴虫感染，这些动物虽未表现任何明显临床症状，但这些无症状感染动物体内寄生虫病的防控尤为重要，因其可将病原广泛传播而被忽视。在动物园中饲养员、管理员、兽医工作者、游客等人员均有机会与野生动物密切接触，由于人五毛滴虫的人兽共患性和宿主广泛性，应积极检测动物园中野生动物的人五毛滴虫感染情况；定期对其生活环境进行清理和消毒，对粪便、脏物进行及时清除；关注动物健康状态，对出现腹泻症状的动物进行隔离和治疗；进行预防性驱虫，防止寄生虫感染和传播。