洪慧颐，杨春燚，王维新，张 迪，林德贵

(中国农业大学动物医学院，北京 海淀 100193)

犬猫真菌性皮肤病由皮肤癣菌侵袭毛发和皮肤角质层引起，可导致动物出现不同程度的瘙痒、皮屑、红疹、斑块状脱毛等临床症状，其中犬小孢子菌是小动物临床常见的皮肤癣菌[1-2]。临床中常用的抗真菌药主要有效成分包括特比萘芬、伊曲康唑、酮康唑等，但随着药物的广泛使用，真菌的耐药性问题也随之而生[2-3]。

近年来，有研究发现臭氧化油对于皮肤癣菌具有良好的抗菌、杀菌效果[4-10]，臭氧能穿透真菌的细胞壁，进入细胞质并破坏细胞功能，达到杀灭真菌的作用。也有研究表明，臭氧能通过抑制皮肤癣菌的产孢能力、增加菌丝营养物质的漏出和降低水解酶的活性，达到抑制和杀灭真菌的效果[8-9]。而动物机体具有良好的抗氧化系统应对臭氧的强氧化性，外用医疗臭氧可在不损害机体的情况下达到杀灭真菌、促进感染性创面修复的功效[11-14]。因此本试验选用商品化人用臭氧化油产品，研究其对犬小孢子菌感染的治疗效果，探讨臭氧疗法应用于犬猫真菌性皮肤病的医疗价值。

1 材料与方法

1.1 实验动物 普通级豚鼠，体重200～250 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物许可证号：SCXK(京)2016—0011。

1.2 试验菌种 犬小孢子菌株，由中国农业大学动物医院检验科临床分离所得，根据患病动物的临床表现、染色镜检、真菌培养以及测序结果，鉴定为犬小孢子菌。

1.3 试验试剂及药品 沙氏葡萄糖琼脂(Sabouraud dextrose agar,SDA)培养基(Solarbio)；RPMI-1640液体培养基(Gibco)；乳酸棉酚蓝(安徽雷根生物技术有限公司)；二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)(Solarbio)；98%伊曲康唑粉剂(上海麦克林生化科技有限公司)。快氧TM臭氧化油抗菌剂(OZONE OIL antibacterial liquid，臭氧含量为25 mg/mL)(北京伟器天成医药科技有限公司)；复方伊曲康唑软膏“霉菌净”(天津市保灵动物保健品有限公司)。

1.4 试验仪器 DNP-9082型电热恒温培养箱(上海精宏实验设备有限公司)；SW-CJ-1B标准型净化工作台(苏州精华设备厂)；BS202光学显微镜(重庆光学和电子设备有限公司)。

1.5 真菌培养 在无菌条件下，用接种环将犬小孢子菌临床菌株接种于SDA培养基上，28 ℃培养14 d备用。

1.6 体内试验

1.6.1 菌悬液的制备 使用转纯后培养14 d的真菌[15]。在无菌条件下，向无菌EP管中加入1～2 mL无菌生理盐水，用玻片或刀片将培养物表面的菌丝和孢子刮至微量离心管中，在振荡器上振荡5 min后静置10 min，过滤沉淀菌丝后用血球计数板计算大分生孢子的浓度，用RPMI-1640液体培养基将菌悬液浓度调整至104CFU/mL备用。

1.6.2 动物模型的建立 共11只豚鼠，用电动剃毛刀将豚鼠腰背部两侧剃毛，形成2个略大于2 cm×2 cm的脱毛区。用砂纸打磨脱毛区皮肤至渗血而不出血，形成2 cm×2 cm的渗血区。用枪头吸取200 μL 104CFU/mL的菌悬液涂布于每一渗血区。接种后每天进行观察，包括豚鼠的精神、食欲、接种区域的症状等。

1.6.3 鉴定感染成功 接种后第3天，观察接种部位的症状，采样接种于SDA培养基观察菌落形态并进行染色镜检，确定为犬小孢子菌感染，则为造模成功。

1.6.4 用药治疗 确定造模成功后，在接种菌悬液第14天时，将11只豚鼠两侧感染部位，即共22个感染部位随机分为3个组，即试验组(n=8)、阳性对照组(n=8)和空白对照组(n=6)。试验组使用快氧TM臭氧化油抗菌剂治疗，阳性对照组使用复方伊曲康唑“霉菌净”治疗，每天用药1次，连续用药2周，空白对照组接种成功后不做任何处理。每周观察记录1次，包括接种部位的症状、真菌培养检查等。豚鼠饲养于同一动物房内，饲料均为同一公司提供的豚鼠专用粮，自由采食和饮水。

1.6.5 疗效判断标准 临床上犬小孢子菌感染的症状包括发红、丘疹、皮屑和角化等，对这4个主要症状用计分法分别进行4级评价，即0=无、1=轻、2=中、3=重，相加后得到总积分。在治疗前和治疗2周后进行评分。按照积分下降指数来对结果进行统计分析。

症状积分下降指数/%=(治疗前总积分-治疗后总积分)/治疗前总积分×100%。

疗效评价分为治愈、显效、好转和无效共4级判定。治愈：用药后症状消失，症状积分下降指数为100%，采样犬小孢子菌镜检、培养阴性；显效：用药后症状基本消失，症状积分下降指数>60%，采样犬小孢子菌镜检、培养阴性；好转：用药后症状减轻，症状积分下降指数30%～60%，采样犬小孢子菌镜检、培养阴性或阳性；无效：用药后症状无改善，症状积分下降指数<30%，采样犬小孢子菌镜检、培养阳性。经疗效判定后，将治愈病例、显效病例和好转病例计为有效病例，计算有效率。

有效率/%=(治愈病例数+显效病例数+好转病例数)/治疗总病例数×100%。

1.7 体外药敏试验 按照美国临床实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)发布的M38-A方案，选用微量液基稀释法测定快氧TM臭氧化油抗菌剂和伊曲康唑对犬小孢子菌的最小抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration,MIC)，每种药物重复测定3次。其中快氧TM臭氧化油抗菌剂的终浓度范围为2.44～1 250 μg/mL，伊曲康唑的终浓度范围为0.031 3～16 μg/mL。将肉眼观察犬小孢子菌生长100%受抑制作为MIC终点判断标准。

2 结果

2.1 体内试验 各组的症状积分下降指数见图1，疗效比较见表1。试验组、阳性对照组、空白对照组的症状积分下降指数平均值分别为47.23%、72.89%、-17.93%，试验组与阳性对照组、空白对照组之间均差异显著(P<0.05)；有效率分别为87.5%、100%、0%。可见在疗效方面，复方伊曲康唑“霉菌净”优于快氧TM臭氧化油抗菌剂。>

图1 症状积分下降指数

表1 疗效比较

在试验过程中，用药开始3～7 d，试验组和阳性对照组均有部分病例出现发红、瘙痒、丘疹等症状加重的现象，但用药2周后均显示好转。两组病例治疗后犬小孢子菌培养结果均为阴性。同时也观察到，相较于阳性对照组(图2)，试验组部分前期症状较严重的豚鼠在治疗期间有更严重的瘙痒、啃咬患部的现象，且患部显得更为干燥(图3)。空白对照组部分病例症状轻微好转，但主要表现为病症恶化(图4)。

图2 复方伊曲康唑“霉菌净”治疗前后对比

图3 快氧TM臭氧化油抗菌剂治疗前后对比

图4 空白对照组

2.2 体外药敏试验 体外药敏试验结果如表2所示，快氧TM臭氧化油抗菌剂对犬小孢子菌的MIC范围为312.5～625.0 μg/mL，高于伊曲康唑的MIC范围(0.5～2.0 μg/mL)。

表2 受试药物对犬小孢子菌的最小抑菌浓度

3 讨论

3.1 药物不良反应 鲁建云等[11]研究发现，在多次给药试验和过敏试验中，基质油(茶油)和臭氧化油均对豚鼠的皮肤具有轻微刺激性且对个别豚鼠轻度致敏，因此笔者认为在临床应用时控制臭氧化油的使用浓度和使用频率，能有效避免其对皮肤的刺激性和过敏性，达到良好的治疗效果。快氧TM臭氧化油抗菌剂是已应用于治疗人类感染性疾病的产品，有明显疗效且并未产生明显不良反应，考虑到豚鼠、犬猫皮肤与人类皮肤的结构存在差异性，可能是由于本药物臭氧浓度过高导致初始症状较严重的豚鼠出现更明显瘙痒、啃咬患部、治疗周期较长的现象。

3.2 本试验的合理性分析 体内试验部分未设置阴性对照组，即用基质油(茶油)治疗，以观察基质油在治疗过程中是否有所作用。有研究表明，茶油具有促进药物经皮吸收的作用，能在一定程度上缓解人类皮肤病症状[16]。Varol等选用橄榄油、氟康唑和臭氧化油进行对比治疗试验，结果显示，橄榄油虽然有一定的抑菌效果，但效果远不及臭氧化油[10]。故猜想本试验中若设置茶油作为阴性对照组，其结果可能是茶油对犬小孢子菌感染有轻微治疗效果，相较于空白对照组更好，但效果仍低于试验组和阳性对照组。茶油主要还是作为臭氧化油的溶剂和透皮剂存在。

体外药敏试验部分，由于目前还没有臭氧化油对犬小孢子菌的MIC测定标准，本试验参考了Thomson等[7]和Geweely[9]的研究，采用微量液基稀释法进行药敏试验。在试验中观察到快氧TM臭氧化油抗菌剂与液体培养基分离的现象，这可能与该产品本身的特性有关；且由于臭氧具有不稳定性，可能在操作过程中分解而无法维持抑菌效果。因此猜想本药敏试验中，臭氧化油的抑菌作用可能是由于油剂覆盖于液体表面创造了无氧环境，从而抑制真菌生长而得。故认为此方法所测定的臭氧化油MIC仅具有试验参考意义。

对于未有明确测定标准的药物与菌株，或者体外药敏试验结果不能反映体内试验结果的情况，李杰[15]认为可以通过琼脂扩散法比较不同药物的抑菌效果，能更为直观地显示药物的抑菌能力与药物间的差异，且结果与临床更为贴切。所以后期再进行臭氧化油抗菌剂的体外药敏试验可考虑采用琼脂扩散法。Geweely[9]用琼脂稀释法测得臭氧化橄榄油(Oleozone)对多种皮肤癣菌的MIC范围为0.53～2.00 mg/mL，其中犬小孢子菌最敏感。

3.3 臭氧化油对真菌性皮肤病的治疗作用 不同研究表明，臭氧化油用于治疗兔子感染犬小孢子菌[5]、红色毛癣菌和白色念珠菌导致的灰指甲病例[4]、小鼠感染犬小孢子菌和石膏样小孢子菌时[7]，均表现出抗真菌活性，可作为治疗临床皮肤癣菌感染的安全替代品。本试验中，试验组用药后临床症状有所好转，真菌培养结果均为阴性，即快氧臭氧化油抗菌剂能够有效抑菌。对于感染犬小孢子菌的犬猫，症状较轻者可以考虑使用快氧臭氧化油抗菌剂治疗；较严重的病例，宜先试用、观察其是否存在不良反应，或者调整臭氧化油的浓度后再投入使用。

此外，Varol等[10]研究指出臭氧化油的抗菌活性与其过氧化值(Peroxide value, PV)有关，而臭氧化的时间和酸碱度均能影响过氧化值。有研究表明，油剂的过氧化值越高，其抗菌、杀菌活性越好[6,10,17]。结合本试验体外部分结果，笔者认为通过调整生产方式、油剂、臭氧含量、使用频率、酸碱度和过氧化值等，臭氧化油有望成为一种新型的抗菌药物应用于犬猫真菌性皮肤病的治疗。后期的试验可评估不同浓度或酸碱度的臭氧化油对皮肤癣菌感染病例的治疗效果，以开发适合犬猫使用的臭氧化油抗菌剂。