APP下载

金黄色葡萄球菌对BV2细胞IFN-α生成的影响

2022-08-26卢婉青赵莎莎蒋松宏童智子黄丹妮郭建华吴俊伟

畜牧兽医学报 2022年8期
关键词:磷酸化结果表明试剂盒

卢婉青,赵莎莎,蒋松宏,童智子,黄丹妮,郭建华, 2,吴俊伟,周 洋, 2*

(1. 西南大学动物医学院,重庆 402460;2. 西南大学医学研究院免疫学研究中心,重庆 402460)

金黄色葡萄球菌(,简称金葡菌)是革兰阳性菌,广泛存在于动物皮肤和黏膜以及环境中,生存能力强,易产生耐药性,释放如肠毒素A、α-溶血素、凝集因子A和杀白细胞素等多种毒素,可引起多种感染性疾病,严重者可导致脓毒血症、败血症或肺炎,危及生命。

IFN是宿主防御时生成的细胞因子,在免疫监视和启动对病原的免疫应答过程中发挥重要作用。IFN分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型,与其受体相互作用后刺激细胞内和细胞间信号转导网络,调控天然免疫和获得性免疫,触发抗感染活性。Ⅰ型IFN最初作为干扰病毒增殖的可溶性因子发现,由天然免疫细胞合成。Ⅰ型IFN家族包括多个结构相似的成员,基因存在于人的9号染色体和小鼠的4号染色体, IFN-α主要由白细胞生成,如淋巴细胞、单核细胞和粒细胞,巨噬细胞源自单核细胞,因此白细胞称为天然的IFN生成细胞,IFN-α称为白细胞IFN。IFN-α有13个亚型,研究非常广泛,其中,IFN-α4直接受IFN调节因子3(interferon regulatory factor 3,IRF3)调控,是微生物感染后最早生成的IFN。Ⅰ型IFN的生成受到TANK结合激酶1(Tank-binding kinase 1,TBK1) /IRF3通路的调控。位于内质网的干扰素基因刺激蛋白(stimulator of IFN genes,STING)识别胞内双链DNA,募集并磷酸化TBK1,TBK1激活后与IRF3相互作用,导致IRF3磷酸化和NF-κB通路激活,促进Ⅰ型IFN的生成。静息状态下,NF-κB与NF-κB抑制剂α(inhibitor of κBα,IκBα)结合处于失活状态,细胞受到刺激时,IκBα发生磷酸化和泛素化,NF-κB与其脱离后激活。金葡菌感染后促进树突状细胞和呼吸道上皮细胞生成Ⅰ型IFN。金葡菌可入侵猪和人的中枢神经系统引起脑部感染,如脑膜炎,但该菌感染小胶质细胞后对Ⅰ型IFN通路的影响尚不清楚。本研究表明,金葡菌感染小鼠小胶质细胞BV2后促进IFN-α生成,该过程依赖于TBK1和NF-κB通路。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

BV2细胞和金葡菌由本实验室保存。

DMEM高糖培养基(C11995500BT)购自Gibco,胎牛血清(P30-3302)购自PAN,胰酶(T8150)和总RNA提取试剂盒(R1200)购自北京索莱宝生物科技有限公司,Mueller-Hinton肉汤(MHB,HB6231)和Mueller-Hinton琼脂(MHA,HB6232)购自青岛海博生物技术有限公司,化学发光液检测试剂盒(WBKlS0100)购自millipore,BX-795(14932)、IMD-0354(17290)和amlexanox(14181)购自Cayman,反转录试剂盒(R312)和ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(Q711)购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司,小鼠IFN-α ELISA试剂盒(SEKM-0149)购自Thermo Fisher。TBK1(ab235253)、p-TBK1(ab109272)抗体购自Abcam,β-actin(66009)、IκBα(10268)和IRF3(113112)抗体购自proteintech,p-IκBα(AP0614)和p-IRF3(AP0623)抗体购自Abclonal,辣根酶标记山羊抗兔IgG(ZB-2301)购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

垂直电泳仪购自Bio-Rad,化学发光成像仪购自Vilber。

1.2 细胞、细菌培养和感染

BV2细胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基置于二氧化碳培养箱培养,二氧化碳浓度5%,细胞汇合度到90%左右时传代,2 d传代一次。金葡菌在MHA平板划线,挑取单克隆接种到MHB 37 ℃过夜培养,50倍稀释培养2.5 h,12 000 r·min离心2 min,PBS洗涤3次,根据试验中指定的MOI加入一定体积的完全培养基,重悬后加入到细胞中,感染后30 min用37 ℃预热PBS洗涤3次,加入含100 μg·mL庆大霉素的完全培养基继续培养至收样。

1.3 Western blot

10 μL样品加入到SDS-PAGE电泳,蛋白转印到PVDF膜上,5%脱脂奶粉37 ℃封闭1 h,一抗(TBK1和p-TBK1抗体5 000倍稀释,其他抗体1000倍稀释)4 ℃孵育过夜,TBST(NaCl 8 g,KCl 0.2 g,Tris base 3 g,Tween-20 1 mL,超纯水1 L,盐酸调pH7.4)洗涤5次,每次5 min,二抗(10 000倍稀释)37 ℃孵育1 h,TBST洗涤5次,每次5 min, 滴加化学发光液,化学发光成像仪曝光。

1.4 实时荧光定量PCR

按照说明书提取总RNA,反转录得到cDNA,实时荧光定量PCR体系:ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL,cDNA 1 μL,上下游引物各0.4 μL,超纯水 8.6 μL。引物序列如表1所示,反应条件:95 ℃ 30 s;95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,40个循环;95 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s,95 ℃ 15 s。-作为内参,相对定量法(2-ΔΔ)分析。IFN-α分别检测-α4和-αn(包括5个亚型,分别为IFN-α1、α2、α7、α11和α12)。

表1 实时荧光定量PCR引物序列

1.5 小鼠IFN-α ELISA

细胞培养液上清1 000 ×离心10 min,取上清,按照试剂盒说明书检测IFN-α浓度。

1.6 数据分析

Image pro plus进行蛋白灰度分析。试验数据经Excel整理,检验分析差异,*表示差异显著(0.01<<0.05),**表示差异极显著(<0.01),GraphaPad prism作图。

2 结 果

2.1 金葡菌促进BV2表达IFN-α

为探明BV2感染金葡菌后IFN-α表达水平的变化,首先检测了金葡菌感染后不同时间点IFN-α的转录水平。结果表明,感染后1 h,IFN-α转录水平没有变化,3~6 h转录水平逐渐上升,12 h降低(图1A)。分别用MOI为8、40和200的金葡菌感染BV2时,IFN-α的转录水平上升呈现剂量依赖性(图1B)。BV2感染金葡菌后ELISA法检测细胞培养液中IFN-α水平发现,感染后1~3 h,IFN-α水平没有变化,6~12 h释放进入培养液中的IFN-α逐渐上升(图1C)。BV2感染不同MOI的金葡菌时,IFN-α的释放量随着MOI的升高而增加(图1D)。

NC表示阴性对照;S.A.表示金葡菌;*.0.01

2.2 金葡菌激活BV2 TBK1/IRF3通路

为阐明金葡菌感染BV2细胞后是否通过该通路诱导IFN-α的生成,首先检测了1和3的转录水平。结果表明,BV2感染金葡菌后1~12 h范围内,1和3的转录水平没有发生变化(图2A、B)。Western blot检测蛋白水平结果表明,感染后1~12 h,TBK1和IRF3的蛋白水平没有变化,但感染后1 h,TBK1和IRF3磷酸化水平开始升高,在1~6 h逐渐升高,12 h下降,但均高于阴性对照组(图2C~E)。分别用MOI为8、40和200的金葡菌感染BV2细胞,6 h后TBK1和IRF3磷酸化水平的升高呈剂量依赖性(图2F~H)。以上结果表明,金葡菌感染BV2细胞后激活TBK1/IRF3通路。

图2 金葡菌感染BV2细胞后激活TBK1/IRF3通路Fig.2 S. aureus activates TBK1/IRF3 pathway following infection in BV2 cells

2.3 金葡菌促进BV2细胞生成IFN-α需要TBK1

为探究TBK1在金葡菌诱导BV2细胞生成IFN-α中的作用,分别用2种TBK1抑制剂BX-795和amlexanox处理细胞后再感染金葡菌。结果表明,BX-795抑制TBK1磷酸化后(图3A和3B),IRF3蛋白水平没有变化,但其磷酸化水平降低(图3A和3C),同时,IFN-α释放量减少(图3D)。aml-exanox处理BV2后,TBK1磷酸化水平没有变化(图3E和3F),p-IRF3蛋白水平下降(图3E和3G),IFN-α释放量减少(图3H)。上述结果表明,TBK1参与BV2感染金葡菌后生成IFN-α。

A~D. BX-795处理;E~H.Amlexanox处理A-D. Treatment with BX-795; E-H. Treatment with amlexanox图3 金葡菌诱导BV2细胞生成IFN-α需要TBK1Fig.3 TBK1 is required for S. aureus-induced IFN-α production in BV2 cells

2.4 金葡菌促进BV2细胞生成IFN-α依赖于NF-κB通路

TBK1激活后介导NF-κB通路活化,促进Ⅰ型IFN的生成。为探明BV2细胞感染金葡菌后生成IFN-α是否依赖于NF-κB通路,首先检测金葡菌感染后是否激活该通路。BV2感染金葡菌后1~12 h,IκBα蛋白水平没有升高,但感染后1 h,p-IκBα蛋白水平开始上升,在1~6 h逐渐升高,12 h略有下降(图4A、B)。为阐明感染金葡菌后IFN-α生成与NF-κB通路激活的关系,用IMD-0354处理BV2后感染金葡菌。结果表明,该抑制剂处理细胞后,p-IκBα 蛋白水平降低(图4C、D),同时伴随p-TBK1和p-IRF3蛋白水平降低(图4C、E和F),并且IFN-α生成减少(图4G)。以上结果表明,BV2细胞感染金葡菌后促进IFN-α生成依赖于NF-κB通路。

图4 金葡菌促进BV2细胞生成IFN-α依赖于NF-κB通路Fig.4 S. aureus-induced IFN-α production is dependent on NF-κB pathway in BV2 cells

3 讨 论

巨噬细胞是细菌等微生物侵入机体后机体防御的第一道防线,在清除病原、维持机体稳态过程中发挥关键作用。小胶质细胞是脑中常驻巨噬细胞,起源于骨髓单核细胞和骨髓造血干细胞,通过自我更新保持一定数量,不通过循环的血祖细胞分化。BV2细胞是用携带致癌基因v-raf/v-myc的反转录病毒J2感染原代小鼠小胶质细胞获得的永生化细胞,常作为替代原代小胶质细胞研究的工具细胞。金葡菌感染可引起人和动物中枢神经系统感染,如脑膜炎,但金葡菌对小胶质细胞的作用尚没有报道,因此本研究通过探索BV2细胞感染金葡菌后Ⅰ型干扰素通路的变化阐明BV2在机体感染金葡菌后发挥的机体防御作用。

Ⅰ型IFN在机体防御细菌感染过程中发挥重要作用。机体感染嗜肺军团菌、链球菌、肺炎双球菌和大肠杆菌后,Ⅰ型IFN的生成增加,抑制细菌的增殖,促进细菌从体内清除。然而,金葡菌可通过操作宿主的免疫系统促进自身的增殖,如自噬和凋亡。金葡菌能入侵吞噬细胞并利用胞内环境促进自身存活和扩散。在树突状细胞中,金葡菌通过Toll样受体9(toll-like receptor 9,TLR9)激活Ⅰ型IFN通路,与野生型小鼠比较,Ⅰ型IFN受体敲除小鼠感染金葡菌后,肺中载菌量下降约20倍,支气管肺泡灌洗液中载菌量更低,死亡率降低70%。本研究发现,金葡菌感染BV2后激活Ⅰ型IFN通路,IFN-α转录水平和释放量升高。

TBK1/IRF3通路介导Ⅰ型IFN的生成,TBK1和IRF3通过翻译后修饰——磷酸化激活。BV2感染金葡菌后1~12 h,TBK1和IRF3在mRNA 和蛋白水平均没有发生变化,但感染后1 h发生磷酸化,IFN-α在感染后3 h mRNA水平升高,6 h释放量显著增加,表明金葡菌激活TBK1/IRF3通路介导IFN-α释放。与此一致的是,TLR4受体激动剂LPS和TLR3受体激动剂poly(I:C)处理小鼠骨髓源巨噬细胞(bone marrow-derived macrophage,BMDM),或水疱性口炎病毒感染HEK293T细胞,TBK1和IRF3蛋白水平没有变化,但介导其发生磷酸化促进了IFN-α释放。

TBK1与ATP结合后促进IRF3磷酸化。Amlexanox通过竞争性结合ATP抑制TBK1活性,但不降低TBK1磷酸化水平,p-IRF3水平下降,是临床上用于治疗癌症的候选药物。Amlexanox处理BV2后感染金葡菌,p-TBK1水平没有变化,p-IRF3水平降低,IFN-α生成减少,同时,BX-795处理细胞感染金葡菌后,p-TBK1和p-IRF3水平以及IFN-α生成量均下降,表明TBK1参与金葡菌促进BV2细胞生成IFN-α。

NF-κB在不同微生物激活Ⅰ型干扰素通路中的作用存在差异。一方面,小鼠巨细胞病毒感染成纤维细胞后,M35蛋白入核,抑制NF-κB活化,从而减少Ⅰ型干扰素的表达。从敲除NF-κB相关蛋白(如RelA、RelB和c-Rel)的小鼠分离的成纤维细胞感染仙台病毒或新城疫细胞,IFN-β的生成下降较少,表明NF-κB在仙台病毒或新城疫细胞诱导I型干扰素生成中的作用较小。另一方面,甲型流感病毒激活NF-κB,促进细胞因子信号转导抑制蛋白3(suppressor of cytokine signaling-3,SOCS-3)表达,抑制Ⅰ型干扰素表达。β-联蛋白(β-catenin)与p300转录辅因子互作,结合IFN-β启动子,促进IFN-β表达,甲型流感病毒通过激活NF-κB抑制过表达β-联蛋白诱导的IFN-β表达水平升高。本研究发现,金葡菌诱导BV2细胞生成IFN-α需要NF-κB的参与。

4 结 论

BV2细胞感染金葡菌后,激活TBK1/IRF3和NF-κB通路,促进IFN-α的生成。

猜你喜欢

磷酸化结果表明试剂盒
为什么确诊新冠肺炎需要核酸检测试剂盒?
黄芪多糖对大鼠脑卒中后抑郁的影响
一次检测多个基因,让肺癌诊疗更精准
热休克蛋白27的磷酸化及其在胁迫应激中的作用
18F—FDG配套试剂盒的开发
质谱法分析大肠癌组织中亲核蛋白A的蛋白质变体
磷酸化肽富集新方法研究进展
册亨县杂交水稻引种试验
体育锻炼也重要
女性体重致癌?