周建福 刘莉莉 黄茂新 王桂芝 张一冰 林 堃

莆田学院附属医院1.新生儿科；2.小儿神经康复科；3.新生儿疾病筛查中心，福建 莆田 351100

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase，G-6-PD）缺乏症是世界上最常见的一种遗传性红细胞酶病［1］，非洲大陆、地中海沿岸国家、中东地区和亚洲是高发区域［2］。我国不同地区人群G-6-PD 缺乏症的发生率相差甚远［3］。国家临床实验中心报告的G-6-PD缺乏症发生率为1∶44［4］。出生前G-6-PD 缺乏症可发生流产、早产、死胎及胎儿水肿；出生后可表现为溶血、贫血、黄疸，严重者并发胆红素脑病，甚至死亡［5］。慢性发病者可出现非球形红细胞溶血性贫血［6］。

目前G-6-PD 缺乏症尚无有效的治疗措施，因此，尽早明确新生儿G-6-PD缺乏症的基因型及酶活性亚型，早发现早预防，对提高本地区出生人口素质和群体生命健康水平具有重要意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

统计2020年7月—2021年6月莆田学院附属医院新生儿疾病筛查中心的25 174 份滤纸片干血斑样本，其中男性13 071例，女性12 103例，男女比为1.08∶1；收集G-6-PD 缺乏症筛查阳性病例共215例，阳性率0.85%；男性176例，女性39例，男女比为4.51∶1。告知受检病例的监护人关于检测G-6-PD缺乏症突变基因及酶活性的必要性，征得监护人同意并签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 采用速率法检测G-6-PD 酶活性 针对G-6-PD 缺乏症筛查阳性病例，采用速率法检测酶活性。静脉空腹采血，检测样本采用压积红细胞，用乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）抗凝血，采集的抗凝血样本密封2 ～8 ℃保存，可稳定2周。样品处理：抗凝血以4 000 r/min离心5 min，避开血浆层用加样器准确吸取压积红细胞20 μL加入到1 mL溶解液中溶解，待红细胞完全溶解后（约1 ～2 min）上机测定，测定时间不得超过25 min，否则会因G-6-PD 失活而造成结果假性偏低。

结果判读：酶活性＜1 700 U/L 为阳性，可生化诊断G-6-PD 缺乏；酶活性≥1 700 ～4 000 U/L 为正常。

1.2.2 采用MMCA 法检测G-6-PD 突变基因 根据2019年新生儿葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症筛查与诊断实验室检测技术专家共识［7］的推荐，采用多色熔解曲线分析法（multicolor melting curve analysis，MMCA）检测G-6-PD 缺乏症突变基因。该检测技术原理是利用DNA 的可扩增性及熔点差值（Tm 值）对突变进行定性检测，采用4 色荧光探针，根据靶序列和探针杂交体熔点变化检出G-6-PD 突变位点。用于体外定性检测人外周血基因组DNA中的中国人群常见的12 种G-6-PD 基因突变：c. 95A＞G、c. 383T＞C、c. 392G＞T、c. 487G＞A、c.517T＞C、c.592C＞T、c.871G＞A、c.1004C＞A、c.1024C＞T、c.1360C＞T、c.1376G＞T、c.1388G＞A。每份检测样本需要通过2 个PCR 体系完成，每个体系有4 种荧光探针。最后，对待测样本与野生型对照对应通道的熔解峰的Tm 值进行计算，判断检测样本是否发生G-6-PD基因突变［8］。

1.3 统计学处理

采用SPSS 22.0 统计学软件进行数据分析。计数资料以相对数表示，组间比较采用χ2检验。检验水准α=0.05。

2 结 果

2.1 G-6-PD酶活性检测结果

215 例G-6-PD 筛查阳性病例行酶活性检测，其中168 例酶活性异常，可生化诊断G-6-PD 缺乏；男性143例，女性25例，男女比为5.72∶1。WHO根据G-6-PD 酶活性变异的程度及临床表现的有无及程度，将G-6-PD 缺乏症分为5个等级［9］。其中Ⅱ级95例（酶活性值32 ～147 U/L），Ⅲ级73 例（酶活性值213～950 U/L）。

2.2 G-6-PD基因突变检测结果

采用MMCA法可同时检测12种常见G-6-PD缺乏症突变基因型。168 例G-6-PD 酶活性异常病例中有145 例（男性124 例，女性21 例）同意接受基因检测，129例确诊G-6-PD 缺乏症突变基因型的分布情况见表1。

表1 129例突变基因分布情况（例）

145 例中检出10 种常见突变基因型，混合突变仅1例。其中男性半合子112例，女性杂合子16例，女性纯合子仅1 例，男女比为6.59∶1；另外16 例基因检测阴性，其中7 例是Ⅱ级酶活性亚型（男性4 例，女性3 例），9 例是Ⅲ级酶活性亚型（男性8 例，女性1例）。

2.3 生化检出率及基因检出率比较

生化检出率比较，男性81.25%（143/176）与女性64.10%（25/39）的差异有统计学意义（χ2=5.495，P=0.019）；基因检出率比较，男性90.32%（112/124）与女性80.95%（17/21）的差异无统计学意义（χ2=0.793，P=0.373）；生化检出率78.14%（168/215）与基因检出率88.97%（129/145）比较，差异有统计学意义（χ2=7.030，P=0.008）。

3 讨论

全世界已发现G-6-PD 缺乏症有400 多个基因突变类型［10］。从全球范围看，非洲大陆以c.202G＞A、c.376A＞G突变为主，位于地中海沿岸的国家和地区以c.563C＞T 突变为主［11］，而东南亚国家主要以c. 871G＞A、c. 1311C＞T 这两种突变类型为主。东亚和南亚最常见的G-6-PD突变类型是c.1003G＞A，又名G-6-PDChatham 突变，主要分布于日本、菲律宾和印度等国家［12］，也有文献报道此突变为几个东亚及伊朗部分省市的第二常见突变［13］。该突变导致G-6-PD 蛋白仅有不到正常蛋白10%的活性。Nuchprayon 等［14］报道在缅甸南部发现1 例c.94C＞G变异，由于变异导致组氨酸变为天冬氨酸，从而影响G-6-PD 蛋白活性。该突变患者酶检测活性为0。中国人群已报道的突变类型有40余种，国内已发现的G-6-PD 基因致病性变异超过30 种，绝大部分为Ⅱ类或Ⅲ类，分布具有种族和区域特异性［15］。G-6-PD 缺乏症是X 连锁不完全显性等位基因异常引起的，基因检测是G-6-PD 缺乏症确诊的重要依据，尤其对于女性杂合子、临床疑似病例和有家族史的患者。女性杂合子由于其X染色体可随机失活，导致部分女性可发病。G-6-PD 致病基因位于Xq28，长约20 kb，包含13 个外显子和12 个内含子，共编码515 个氨基酸的蛋白酶［16］，起始密码子位于第2 外显子，第1外显子不参与翻译。G-6-PD 缺乏症基因突变以单个碱基置换的错义突变为主。

本组168 例酶活性异常病例中，其中男性检出率为81.25%，女性检出率为64.10%，表明采用速率法检测酶活性可初步检出80%左右本地区男性新生儿G-6-PD缺乏症病例，适合在缺乏基因检测条件的基层医院推广应用。而女性病例生化检出率比较低，提示女性病例更有必要采用基因检测以明确诊断。从筛查阳性到基因确诊，男女比例由4.51∶1（176/39）扩大到6.59∶1（112/17），反映出部分女性杂合子可能被漏诊。本组病例基因检出率88.97%明显高于生化检出率78.14%；但男性生化检出率81.25%与女性基因检出率80.95%相近；男女性常见突变基因检出率分别为90.32% 和80.95%，两者差异无统计学意义，提示酶活性异常病例的突变基因检出率不存在性别差异。对比唐芳等［17］报道的酶活性异常病例中男女性常见突变基因检出率分别为96.93%和90.52%，发现本组女性病例的突变基因检出率与该报道有差距，可能提示本地区女性G-6-PD 缺乏症突变基因型更具区域特点，需要进一步研究证实。

本组病例中检测出10 种常见突变基因型和1 种混合突变。比较陈瑶等［18］报道的应用Massarray（质量阵列）基因芯片技术共检出9种新生儿G-6-PD缺乏症单纯型单点突变和7种复合突变，前3顺位突变基因型为：c. 1376G＞T、c. 1388G＞A 及c.95A＞G。除了第一顺位都是最常见的c.1376G＞T外，其他顺位及基因型都不一致，表明与地域差异有关。129 例基因确诊病例中112 例为男性半合子，16 例为女性杂合子，1 例女性纯合子，仅1 例女性纯合子和3例男性半合子有明确家族成员患G-6-PD 缺乏症病史，显示G-6-PD 缺乏症呈X 连锁不完全显性遗传。之所以男性发病居多，因为男性只有1 条G-6-PD 拷贝，而女性有2 条G-6-PD 拷贝，仅依靠正常表型不能区分其为纯合子或杂合子。当为杂合子时，有一正常基因可合成正常的G-6-PD，其等位基因则合成变异的G-6-PD，这种双向合成使红细胞表现为两种情况，一种正常，一种则缺乏G-6-PD 酶。这就使女性杂合子G-6-PD 缺乏症难以诊断，因为正常红细胞部分掩盖了异常红细胞，其酶活性变化范围较大，常在正常范围之内，也可呈轻度至重度降低［19-20］。女性杂合子发病与否取决于其G-6-PD缺乏的细胞数量在细胞群中所占的比例，由于临床上不同的表现程度，称为不完全显性［21］。

本组病例的酶活性亚型分布以Ⅱ级和Ⅲ级为主，没有发现Ⅰ级、Ⅳ级和Ⅴ级亚型。与国内报道［22］基本一致。另外，接受基因检测的145 例酶活性异常病例中，除外129 例基因确诊，还有7 例Ⅱ级亚型和9 例Ⅲ级亚型未检出突变基因。由于MMCA 法仅检测12 种常见基因变异位点［7］，易将其他突变位点漏诊。中国已有35 种致病突变被证实［23］，尚缺乏大型流行病学调查数据，Liu 等［24］对2013 至2017年多中心1 764 299 例新生儿筛查样本进行基因检测发现29 种基因变异，其中c.1388G＞A、c.1376G＞T 和c.95A＞G 仍然是我国南方地区最常见变异位点，且仅在华人中存在，世界其他民族未见报道。本组病例中最常见的3种突变类型与国内报道的前3 种突变基因型及顺位都不一致［18，24］，显示本地区G-6-PD 缺乏症突变基因型独具地域特色的可能性，有必要通过基因测序分析以鉴定12 种基因型之外的其他常见突变位点和新的突变位点［7］。

随着新生儿G-6-PD缺乏症筛查在我国推广，基因型与生化表型的关系受到关注［25］，目前有关G-6-PD 基因型与新生儿筛查干血斑G-6-PD 酶活性的关系尚不十分清楚。郭静等［26］报道的G-6-PD 基因突变位点与G-6-PD活性无明显相关性，临床不能以该病患儿G-6-PD 基因突变位点推测其G-6-PD 活性。陈乡等［27］报道的单中心研究显示，携带相同G-6-PD致病变异同性别患儿的表型谱有较大差异，携带相同致病位点且酶活性一致的同性别患儿临床表现亦有差异。

综上所述，采用速率法检测酶活性及MMCA法检测突变基因，对G-6-PD缺乏症的酶活性分型及基因型确诊都有意义。下一阶段将采用基因测序分析联合多色熔解曲线分析法探讨G-6-PD 缺乏症基因变异位点与酶学表型的关联性。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突