李 猛，杨 力，朱建勇，尹义平，郭雅君

（湖北省十堰市人民医院·湖北医药学院附属人民医院呼吸与危重症医学中心，湖北 十堰 442000）

肺癌是最常见癌症，其中约有83%为非小细胞肺癌（NSCLC）［1］。虽然手术、化学药物治疗（简称化疗）、放射治疗（简称放疗）、免疫治疗等方案均可在一定程度上改善NSCLC 患者的预后，但对于肿瘤发生转移者，其5 年相对生存率仅约15%［2］。松果菊苷属苯乙醇苷类化合物，具有清除氧自由基、抑制炎症和调节免疫等药理活性［3］。松果菊苷能诱导乳腺癌细胞凋亡，同时抑制急性髓系白血病细胞增殖，但其对肺癌作用的研究较少［4-5］。上皮 -间充质转化（EMT）与恶性肿瘤的迁移和侵袭密切相关，虽有大量研究揭示了EMT 在NSCLC 进展中的作用，但调控EMT 的分子机制尚未明确［6］。转化生长因子-β1（TGF-β1）通过经典的Smad 信号或非典型信号传导，成为NSCLC EMT 和转移的驱动因素［7］。在TGF - β1信号通路中，TGF - β1通过结合TGF - βⅠ型受体（TβRⅠ）激活信号，进而通过磷酸化激活Smad 2和Smad 3，被激活的Smad2 和Smad3 进一步与Smad 4相互作用，激活或抑制其靶基因（如SNAIL）［8］。本研究中探讨了松果菊苷对人肺癌HCC827 细胞增殖和迁移的影响，以及TβRⅠ/ Smad 信号通路在整个过程中的作用。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器、试药与细胞

仪器：3000T 型 CO2培养箱（美国 Thermo Revco 公司）；Sunrise型全自动酶标仪（瑞士Tecan公司）；CKX53型倒置显微镜（日本Olympus 公司）；BD FACSCanto 型流式细胞仪、Stepone 型Real - time PCR 扩增仪和Mini Protean 3型BD垂直电泳仪（美国ABI公司）。

试药：松果菊苷（苏州润新生物科技有限公司，批号为82854-37-3，纯度 98%）；DMEM 培养基、胎牛血清（美国Hyclone 公司）；四氮唑蓝（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）均购自美国 Amresco 公司；AnnexinV/ PI 细胞凋亡检测试剂盒（美国BD 公司，批号为0220496）；Trizol（美国Invitrogen 公司，批号为170933）；基质金属蛋白酶 - 9（MMP - 9）、mRNA 反转录试剂盒和实时荧光定量聚合酶链式反应（qPCR）试剂盒（宝生物工程＜大连＞有限公司，批号分别为20210376，20211208）；RIPA裂解液（北京索莱宝生物技术公司，批号为SL059332）；TβRⅠ、Smad 2、Smad 3 和β - actin（美国 Santa Cruz 公司，批号分别为210383，210315，210564，211206）；辣根过氧化物酶（HRP）标记山羊抗鼠免球蛋白（IgG，美国Abcam公司，批号为AB21054372）。

细胞：人肺癌HCC827细胞（中国科学院细胞库）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与分组

在37 ℃及5% CO2条件下，用含10%胎牛血清的DMEM 培养基培养HCC827 细胞，隔天换液。实验分为阴性对照组（等体积培养基）、阳性对照组（顺铂80µmol/L）及松果菊苷低、中、高剂量组（实验Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ组，20，40，80 µmol/L）。

1.2.2 观察指标及检测

细胞增殖能力：采用MTT 法。取对数生长期细胞，接种于96 孔板（每孔3× 103个），在37 ℃及5%CO2条件下，每孔以0（对照），5，10，20，40，80，160 µmol/L 松果菊苷或0（对照），5，10，20，40，80，160，320 µmol/ L 顺铂孵育24 h，加入MTT（每孔20 µL），继续培养4 h，弃上清液，加入DMSO（每孔200 µL）振荡10 min，以酶标仪在570 nm波长处测定吸光度值（OD值），平行测定3次，并计算细胞增殖率。细胞增殖率（%）=OD用药组/OD对照组×100%。以增殖率为50%时的药品质量浓度为半数致死浓度（LC50）。

细胞迁移能力：采用细胞划痕法。取各组对数生长期细胞，接种于6 孔板中（每孔1× 106个），以100µL 灭菌枪头在单层细胞上呈“一”字划痕，将细胞用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗划痕。各组以相应药液孵育24 h，从每个划痕伤口中随机选择5个视野，显微镜下观察，以图像分析仪测量划痕宽度。划痕越宽，表明细胞迁移能力越弱。

细胞凋亡情况：采用流式细胞术。取各组对数生长期细胞，接种于 6 孔板中（每孔1 × 106个），孵育细胞24 h，预冷PBS 洗涤，离心弃上清液，用Annexin V Binding Solution（1 ×）调整细胞密度为1 × 106/mL，悬浮于400µL V-FITC 溶液中，黑暗中室温孵育15 min，加入PI 10 µL，4 ℃避光孵育5 min，以流式细胞仪检测细胞凋亡情况，并计算凋亡率。

MMP-9，TβRⅠ，Smad 2，Smad 3 mRNA表达水平：采用qPCR 法。取各组对数生长期细胞，接种于6孔板中（每孔1×106个），孵育细胞24 h，用预冷PBS洗涤，离心弃上清液，用Trizol提取总RNA，反转录制备cDNA。PCR反应条件为，95 ℃预变性10 s；94 ℃变性15 s，40个循环；55 ℃退火30 s；70 ℃延伸30 s 终止反应。以 2-△△Ct法计算MMP-9，TβRⅠ，Smad 2，Smad 3 mRNA 的相对表达量。各组设3个复孔，实验重复3次。引物序列见表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer′s sequence

TβRⅠ，Smad 2，Smad 3 蛋白表达水平：采用Western blot法。取各组对数生长期细胞，接种于6孔板中（每孔1× 106个），孵育细胞24 h，用预冷PBS 洗涤，离心弃上清，加入RIPA 裂解液裂解2 h，离心取上清，电泳，转到聚偏二氟乙烯膜上，然后用5%脱脂牛奶在室温下封闭 1 h，将膜与 TβRⅠ（1∶400）、Smad 2（1∶200）、Smad 3（1∶300）和 β - actin（1∶1 000）抗体孵育，4 ℃过夜，将HRP 标记山羊抗鼠 IgG（1∶10 000）在室温下孵育30 min，显色，采集图像，利用Image J 软件分析目的条带与内参条带灰度比值，即为各目的蛋白相对表达量。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 细胞增殖能力和LC50

随着松果菊苷浓度的增加（10～160 µmol / L）与0 µmol/L 比较，细胞增殖率显著降低（P＜ 0.05）。当松果菊苷浓度为40µmol/L 时，增殖率约为50%，LC50为（47.50±6.21）µmol/L，故选择40µmol/L为松果菊苷干预浓度。随着顺铂浓度的增加（10～320 µmol/ L）与0 µmol/L 比较，细胞增殖率显著降低（P＜ 0.05），当顺铂浓度为 80 µmol/ L 时，增殖率约为 50%，LC50为（76.85 ± 14.89）µmol/L，故选择80 µmol/L 为顺铂干预浓度。结果见表2。

表2 松果菊苷及顺铂对HCC827细胞增殖的影响（，%，n=3）Tab.2 Effects of echinacoside and cisplatin on the proliferation of HCC827 cells（，%，n=3）

表2 松果菊苷及顺铂对HCC827细胞增殖的影响（，%，n=3）Tab.2 Effects of echinacoside and cisplatin on the proliferation of HCC827 cells（，%，n=3）

注：与0 µmol/L比较，#P ＜ 0.05。Note：Compared with those at 0 µmol/L，#P ＜ 0.05.

序号松果菊苷浓度（µmol/L）F值P值顺铂浓度（µmol/L）F值P值1 2 3 4 5 6 7 8 0 5 1 0 0 5 1 0 20 40 80 160细胞增殖率（%）100.00±12.43 97.25±8.68 84.56±2.59#69.40±8.10#55.29±8.13#29.62±6.07#5.41±1.41#64.813＜0.00120 40 80 160 320细胞增殖率（%）100.00±8.28 95.28±3.39 85.11±4.43#73.20±5.21#62.16±5.27#47.26±4.46#26.58±5.84#7.17±1.83#52.142＜0.001

2.2 细胞迁移和凋亡情况

与阴性对照组比较，阳性对照组及实验Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ组细胞迁移距离缩短，细胞凋亡率显著升高（P＜0.05）。详见表3和图1、图2。

图1 HCC827细胞迁移情况Fig.1 The migration of HCC827 cells

图2 HCC827细胞凋亡情况Fig.2 The apoptosis of HCC827 cells

2.3 细胞中mRNA 及蛋白表达水平

与阴性对照组比较，阳性对照组及实验Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ组细胞中TβRⅠ，Smad 2，Smad 3 mRNA 及蛋白表达水平均显著降低（P＜ 0.05）。详见表3。

表3 各组HCC827细胞迁移、凋亡情况及细胞中mRNA和蛋白表达水平比较（，n=3）Tab.3 Comparison of migration，apoptosis and the mRNA and protein expression levels of HCC827 cells in each group （，n=3）

表3 各组HCC827细胞迁移、凋亡情况及细胞中mRNA和蛋白表达水平比较（，n=3）Tab.3 Comparison of migration，apoptosis and the mRNA and protein expression levels of HCC827 cells in each group （，n=3）

注：与阴性对照组比较，*P ＜0.05。Note：Compared with those in the negative control group，*P ＜ 0.05.

组别mRNA 蛋白浓度（µmol/L）0 80 20 40 80 HCC827细胞迁移距离（µm）38.15±4.59 16.52±3.49*31.10±4.58*24.29±3.61*19.54±2.39*15.841＜0.001 Smad 3 0.47±0.05 0.16±0.05*0.39±0.08*0.31±0.04*0.23±0.05*14.620＜0.001细胞凋亡率（%）0.16±0.06 1.14±0.34*0.21±0.05*0.32±0.06*0.83±0.09*27.306＜0.001阴性对照组阳性对照组实验Ⅰ组实验Ⅱ组实验Ⅲ组F值P值TβRⅠ1.00±0.10 0.43±0.08*0.91±0.04*0.82±0.05*0.61±0.12*12.637＜0.001 Smad 2 1.00±0.06 0.16±0.05*0.76±0.08*0.60±0.15*0.37±0.09*25.339＜0.001 Smad 3 1.00±0.05 0.38±0.06*0.84±0.09*0.69±0.04*0.53±0.07*19.205＜0.001 TβRⅠ0.53±0.08 0.12±0.03*0.33±0.05*0.25±0.07*0.18±0.04*23.352＜0.001 Smad 2 0.41±0.05 0.09±0.02*0.29±0.04*0.20±0.05*0.14±0.02*26.173＜0.001

3 讨论

松果菊苷可通过诱导肝癌细胞凋亡抑制肝癌进展，对胰腺癌、乳腺癌等肿瘤细胞也有抑制作用［9］。研究发现，松果菊苷通过抑制EMT，进而抑制急性髓系白血病细胞体外迁移［4］，但松果菊苷对HCC827 细胞的抗转移作用尚未见报道。本研究中，松果菊苷以剂量依赖的方式抑制HCC827 细胞的迁移和增殖，并诱导其凋亡；同时，松果菊苷可抑制TβRⅠ/Smad 信号通路，作用虽无顺铂强，但潜在副作用较低。

EMT 在肿瘤细胞转移早期起着至关重要的作用，因为细胞失去黏附，获得了更强的迁移和侵袭能力，向远处组织扩散。EMT 的调控涉及多种信号通路，其中TGF- β 信号通路较典型［10］。TGF- β 主要由白细胞介素4（IL-4）或白细胞介素13（IL-13）刺激免疫细胞分泌，也可由TGF - β 激活的Ⅱ型肺泡上皮细胞、成纤维细胞、细胞外基质释放［11］。TβRⅠ与TβR Ⅱ结合形成一种能识别并结合配体的复合物（TGF - β）。TGF - β 可上调TβRⅠmRNA 和蛋白表达，诱导细胞内TβRⅠ肽磷酸化，激活细胞内信号转导，包括Smad 通路和非Smad 通路的信号转导［12］。在 TβRⅠ / Smad 通路中，激活TβRⅠ使Smad 2/3 磷酸化水平升高，并与Smad 4 结合形成 Smad 2/3-4 复合物［13］。Smad 7 属 Smad 通路拮抗剂，它可抑制Smad 2/3 的磷酸化和Smad 2/3-4 复合物的形成，并且抑制TGF - β 下调［14］。Smad 2/ 3 - 4复合物随后易位进入细胞核，作为转录因子，导致纤维化转录因子上调［15］。靶向 TβRⅠ的抑制剂，如 LY -2157299、EW7197、SD - 208 和 SB431542，成功地抑制了临床前模型和Ⅰ～Ⅲ期临床试验中的肿瘤进展［16］。本研究结果显示，松果菊苷可降低HCC827细胞中TβRⅠmRNA 和蛋白表达水平，并抑制Smad 2 和Smad 3 mRNA 和蛋白表达，表明松果菊苷具有抑制HCC827 细胞增殖和迁移的作用。

此外，TβRⅠ也可直接激活非Smad信号通路，包括丝裂原活化蛋白激酶/ c - Jun 氨基末端激酶（MAPK/JNK）、MAPK/p38和磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信号通路，可直接或间接调控细胞凋亡［17］。在MAPK/ JNK 和MAPK/ p38 信号通路中，体外结果显示，经 SP - 600125 处理 24 h 后也降低了 JNK 和 p38 的磷酸化水平，诱导肿瘤细胞凋亡［18］。同时，SD - 208 对MAPK/ JNK 和MAPK/ p38 信号通路的抑制作用被SB203580 处理逆转［19］。本研究结果显示，松果菊苷可诱导HCC827 细胞凋亡，这可能与TβRⅠ可直接激活非Smad 信号通路有关，但本研究中未对TβRⅠ非smad 信号通路进行研究，后续将持续完善。

综上所述，松果菊苷可抑制HCC827 细胞增殖及迁移，并促进细胞凋亡，机制可能与其抑制TβRⅠ/Smad信号通路激活有关。