田良良 叶洪丽 席寅峰 黄宣运 王 媛 孔 聪 沈晓盛 蔡友琼

（中国水产科学研究院东海水产研究所， 农业农村部水产品质量安全控制重点实验室， 上海 200090）

河鲀 （Tetraodontidae） 俗称河豚鱼 （Puffer fish）， 是硬骨鱼纲鲀科鱼类的统称， 因肉质鲜美，营养丰富， 生食、 熟食皆宜， 自古以来被视为餐桌上的珍品。 民间有 “拼死吃河鲀” 的说法， 是因为河鲀鱼体内含有河豚毒素 （Tetrodotoxin， TTX），若加工处理不当会引起食物中毒， 甚至死亡。

河豚毒素呈无色针状结晶体， 耐酸、 耐高温，性质稳定， 是一种剧毒的生物碱类天然神经毒素[1]，也是一种高特异性的电压门控钠通道阻滞剂[2]， 其在临床与神经学研究领域具有很多潜在的医学研究价值， 目前被认为是自然界所发现的毒性最强的神经毒素之一[3]。 河豚毒素最早是1909 年由日本科学家从河鲀卵巢中提取得到， 1964 年在蝾螈[4]体内也发现了河豚毒素， 后来在其他海洋生物[5～11]、 陆生生物[12～14]及细菌[15～16]体内也检测到了河豚毒素。河豚毒素在河鲀的卵巢、 内脏、 鱼皮、 鱼肉等各个组织器官中都可能存在[17]， 我国在1990 年颁布的《水产品卫生管理办法》 中规定 “河豚鱼有剧毒，不得流入市场， 应剔出集中妥善处理， 因特殊情况需进行加工食用的应在有条件的地方集中加工”（该办法于 2010 年废止）。 2011 年 6 月 9 日， 原国家食品药品监督管理局在 《关于餐饮服务提供者经营河鲀鱼有关问题的通知》 中也明令 “在国家有关政策调整前， 严禁任何餐饮服务提供者加工制作河鲀”。

近年来随着河鲀养殖技术的迅速发展， 养殖河鲀的毒性与野生河鲀相比大大降低， 经加工处理后甚至可达到无毒水平[18～20]。 因此， 2016 年， 原农业部和原国家食品药品监督管理总局联合发布了《关于有条件放开养殖红鳍东方鲀和养殖暗纹东方鲀加工经营的通知》（农办渔〔2016〕53 号）， 对符合条件的养殖红鳍东方鲀和养殖暗纹东方鲀企业实行有条件放开。 2020 年全国养殖河鲀总产量为2.68万t， 主要养殖省份为福建 （产量占比39.1%）、 广东（产量占比28.7%）、 江苏 （产量占比13.1%）、 河北（产量占比8.0%） 等[21]。 随着养殖河鲀市场的放开， 养殖河鲀的食用安全性也引起人们的关注。 本文对2015－2021 年养殖河鲀中的河豚毒素含量进行测定分析， 并对目前养殖河鲀的食用安全性进行暴露评估。

随着养殖河鲀养殖规模和市场需求的扩大， 河鲀的消费量会越来越大， 为了保证人们食用河鲀的安全性， 需要建立符合我国国情的河豚毒素限量标准。 本文通过分析毒理学数据对我国养殖河鲀中河豚毒素的限量值提出建议， 为监管部门的日常监控提供参考依据， 同时为广大消费者的食用安全提供保障。

一、 材料与方法

（一） 材料与试剂208 个河鲀样本来源于2015－2021 年河鲀监控项目和企业委托项目， 包括： 2015 年抽取的福建、 江苏、 上海等养殖河鲀企业生产和销售的115 个养殖河鲀样品， 其中暗纹东方鲀91 个、 菊黄东方鲀8 个、 条纹东方鲀15 个和杂交河鲀 （菊黄东方鲀和暗纹东方鲀杂交） 1个； 2015 年 4－11 月， 每月分别抽取的江苏省南通中洋集团股份有限公司和上海阿顺特养殖有限公司的暗纹东方鲀， 共计31 个样品； 2016 年河鲀有条件放开后对鱼源基地评审委托检测的河鲀样品，2017－2021 年共计62 个样品， 其中暗纹东方鲀48个、 红鳍东方鲀14 个， 样品主要来自于江苏（样品数量占比29.0%）、 广东 （样品数量占比21.0%）、河北 （样品数量占比14.5%）、 福建 （样品数量占比11.3%）、 上海 （样品数量占比11.3%） 等地。

河豚毒素免疫亲和柱 （1 000 ng， 3 mL）， 江苏美正生物科技有限公司； 河豚毒素标准品 （纯度≥99%）， 成都曼思特生物科技有限公司； 乙腈（色谱纯）， 美国 J.T.Baker 公司； 甲醇 （色谱纯），美国 J.T.Baker 公司； 甲酸 （色谱纯）， 美国 Supelco 公司； 冰乙酸、 氯化钠、 十二水合磷酸氢二钠、二水合磷酸二氢钠、 氢氧化钠 （分析纯）， 中国医药集团有限公司。

（二） 仪器与设备Thermo TSQ Quantum 液相色谱－质谱联用仪， 配有电喷雾离子源 （ESI）， 美国Thermo 公司； 高速冷冻离心机， 美国Thermo 公司。

（三） 方法本文提取净化方法、 色谱和质谱仪器条件参考GB 5009.206－2016[22]标准方法中第二法。

1.提取净化。 用水清洗鱼体表面的污物， 滤纸吸干鱼体表面的水分后用刀将鱼体分解成肌肉、 肝脏、 皮和性腺等部分， 各部分组织分别用水洗去血污， 滤纸吸干表面的水分后将各组织切碎， 充分均质。

准确称取均质混匀后的样品5.00 g （精确到0.01 g） 于30 mL 具塞聚丙烯塑料离心管中， 加入10 mL 1%乙酸－甲醇溶液， 漩涡混匀2 min， 40℃超声提取 15 min， 以 6 000 r/min 离心 5 min。

取7 mL 上清液于50 mL 塑料离心管中， 加入27 mL PBS 溶液 （0.05 mol/L， pH 7.3） 稀释， 用 1 mol/L 氢氧化钠溶液调整 pH 至 7 左右， 用 PBS 溶液定容至35 mL， 用玻璃纤维滤纸过滤。

取10 mL 过滤液过免疫亲和柱， 4 mL 2%乙酸－甲醇溶液洗脱， 将洗脱液于40℃条件下氮气吹干， 用55%乙腈水溶液定容至1 mL， 混匀后用0.22 μm 有机滤膜过滤至样品瓶待测。

2.色谱条件。 色谱柱为 TSK－gel Amide－80 色谱柱 （100 mm×2.0 mm， 5 μm）； 流动相为乙腈－0.1%甲酸水溶液 （55∶45，V∶V）； 流速为 0.3 mL/min； 柱温为 35℃； 进样量为 10 μL。

3. 质谱条件。 离子源为电喷雾离子源 （ESI），正离子模式； 扫描方式为选择反应监测 （SRM），选择反应监测母离子 （m/z） 320.2， 子离子 （m/z）302.2、 162.2， 碰撞能量 26、 36eV； 喷雾电压为3 500 V； 碰撞气 （氩气） 压力为 0.2 Pa。

（四） 采用食品安全指数进行暴露评估由于河豚毒素的毒害作用与其进入人体的绝对量有关，因此评价其安全性以人体对河豚毒素的实际摄入量与其急性参考剂量相比较的方式更为科学合理， 所以对河鲀中河豚毒素的暴露评估通过导出可以用来评价食品中某种化学物质残留对消费者健康影响的食品安全指数 （IFS）[23]来进行。

养殖河鲀中河豚毒素对消费者健康影响的食品安全指数计算方法见公式 （1）。

公式（1）中， EDI 为河豚毒素的一餐实际摄入量估算值（μg）； ARfD 为急性参考剂量， 即一餐摄入对人类健康没有任何影响的河豚毒素量 （μg/kg）；bw 为平均体重 （kg）， 缺省值为 60。

采用公式 （1） 来计算河豚毒素的食品安全指数， 根据计算结果可以得出其对食品安全的影响程度。 可以预期的结果是： IFS<<1， 河豚毒素对食品安全没有影响； IFS ≤1， 河豚毒素对食品安全影响的风险是可以接受的； IFS>1， 河豚毒素对食品安全影响的风险超过了可接受的限度。

二、 结果

（一） 检测方法线性范围、 准确度、 精密度河豚毒素系列梯度标准溶液采用基质空白溶液配制，以峰面积为纵坐标， 以浓度为横坐标， 绘制标准曲线， 计算相关系数。 结果显示， 标准曲线线性范围为 0.5～60 ng/mL， 相关系数 （R2）＞0.999。

以空白基质加标， 信噪比 （S/N）≥3 和信噪比（S/N）≥10 所对应的河豚毒素的浓度求得方法检出限和定量限， 方法检出限和定量限分别为1 μg/kg和 3 μg/kg。

以空白基质加标， 进行3 个浓度水平分别为3、 10、 20 μg/kg 的添加回收实验， 重复 6 次实验计算精密度。 在上述添加水平下河豚毒素的回收率范围为87%～108%， 相对标准偏差为3%～10%。结果表明， 采用本方法测定河鲀中河豚毒素得出的结果是准确可靠的。

（二） 养殖河鲀专项监测结果2015 年， 对在福建省、 江苏省和上海市等河鲀主产区的养殖企业和销售市场中抽取的115 个养殖河鲀样品进行了河豚毒素检测， 其中所有样品均进行了肌肉中河豚毒素的检测； 44 个样品同时进行了皮和肝脏中河豚毒素的检测； 41 个样品同时进行了性腺 （包括18个卵巢和23 个精巢） 中河豚毒素的检测。 各类养殖河鲀样品中河豚毒素的检出结果见表1。 检测结果显示， 115 份肌肉样品中有2 个暗纹东方鲀的肌肉检出河豚毒素， 检出值分别为2.28 μg/kg 和3.69 μg/kg； 18 份卵巢样品中有1 个菊黄东方鲀和1 个条纹东方鲀的卵巢检出河豚毒素， 检出值分别为22.31 μg/kg 和 3.62 μg/kg； 44 份皮样品、 44 份肝脏样品和23 份精巢样品均未检出河豚毒素。

表1 上海市、 福建省和江苏省等地区养殖河鲀中河豚毒素的检出结果

（三） 不同时间抽样的暗纹东方鲀样品中河豚毒素检出结果从江苏和上海两个河鲀养殖公司共抽取31 个暗纹东方鲀样品， 对其进行肌肉中河豚毒素的检测， 取样月份、 样品数量及检测结果见表2。 结果显示， 4－10 月的河鲀样品中均未检出河豚毒素， 11 月抽取的河鲀肌肉中检出了河豚毒素，检出值为3.69 μg/kg， 这也与文献报道的冬季河豚毒素的检出水平是最高的结论相一致[24]， 样品总体检出率为3.23%。

表2 不同月份养殖河鲀样品中河豚毒素检测结果 （个）

（四） 河鲀鱼源基地评审委托的河鲀样品检测结果2017－2021 年， 笔者工作单位作为养殖暗纹东方鲀和养殖红鳍东方鲀鱼源基地评审的技术机构， 对养殖企业送检的48 个暗纹东方鲀样品和14个红鳍东方鲀样品进行了肌肉和皮中河豚毒素的检测， 同时也对部分样品的肝脏和性腺等组织进行了河豚毒素的检测。 48 个暗纹东方鲀样品和14 个红鳍东方鲀样品的检测结果见表3。 结果显示， 62 个样品中有4 个暗纹东方鲀和1 个红鳍东方鲀的组织中检测出河豚毒素 （见表4）， 样品总体检出率为8.06%， 肌肉、 皮、 肝脏、 性腺均有检出， 不同组织检出率分别为1.61%、 4.84%、 4.44%、 42.86%，检出值为2.97～28.88 μg/kg， 其中性腺中的河豚毒素检出率最高和检出值最大。

表3 不同品种河鲀的不同组织中河豚毒素检出结果

表4 河豚毒素阳性样品的检出值 （μg/kg）

三、 分析与讨论

（一） 3 种来源养殖河鲀中河豚毒素综合结果分析通过分析以上3 种来源的养殖河豚中河豚毒素的检测结果得出， 不同来源样品的不同组织中河豚毒素的检出率表现不同， 其中河鲀肌肉 （1.61%～3.23%）、 皮 （0～4.84%） 和肝脏 （0～4.44%）的检出率差异不大， 性腺 （4.88%～42.86%） 检出率差异较大。 性腺中河豚毒素检出率差异大主要是因为河鲀性腺的发育与季节有关， 很多样品检测时其性腺还未发育， 所以较小的样本量 （鱼源基地评审性腺样品只有7 个） 造成了较大的差异。 样本量较大的养殖河鲀专项和鱼源基地评审的河鲀肌肉样本中河豚毒素检出率 （1.74%与1.61%） 很接近，说明不同来源、 不同产地的河鲀中河豚毒素的检出情况几乎无差异， 所以3 种来源的所有河鲀样品的综合情况具有一定的代表性。

本文自 2015－2021 年， 共对 208 个养殖河鲀样品进行了检测， 其中暗纹东方鲀170 个、 红鳍东方鲀14 个、 菊黄东方鲀8 个、 条纹东方鲀15 个和杂交河鲀1 个； 检测组织样本量为451 份， 其中肌肉 208 份、 皮 106 份、 肝脏 89 份、 性腺 48 份。208 个河鲀样品中共有10 个样品检出河豚毒素，样品总体检出率为4.81%； 检出河豚毒素的组织样本为肌肉 4 份、 皮 3 份、 肝脏 2 份、 性腺 5 份， 不同组织的检出率分别为1.92%、 2.83%、 2.25%、10.42%， 不同组织的检出最高值分别为 6.08、13.92、 4.40、 28.88 μg/kg。

（二） 食用养殖河鲀的河豚毒素暴露评估河豚毒素中毒潜伏期短， 一般食用后0.5～3 h 内发病， 轻度中毒口唇、 舌尖、 手指会出现麻木感， 重度中毒会全身麻木、 呼吸困难甚至死亡， 死亡率高。 虽然连续口服低剂量的河豚毒素对肾脏和心脏有一定的有害影响[25]， 但主要危害是一次食用量过多带来的生命危险， 所以采用急性参考剂量（ARfD） 进行暴露评估。

由于目前缺乏人体的河豚毒素毒理学数据， 而河豚毒素的种间差异是有限的[26]， 所以直接使用小鼠的毒理学数据也相对准确， 监测小鼠2 h 后确定的急性口服无可见不良作用剂量 （NOAEL） 为75 μg/kg （TTX/ 体重）[27]， 即将河豚毒素的急性参考剂量 （ARfD） 按 75 μg/kg 计。 养殖河鲀不同组织的河豚毒素食品安全指数计算结果见表5。 如表5所示， 肌肉、 皮、 肝脏、 性腺的食品安全指数均小于 0.01 （IFS<<1）， 说明养殖河鲀肌肉、 皮、 肝脏、性腺中的河豚毒素对食品安全均没有影响， 即养殖河鲀中河豚毒素对食品安全没有影响。

表5 养殖河鲀不同组织的河豚毒素食品安全指数

养殖河鲀的肌肉、 皮、 肝脏的河豚毒素检出率均小于3%， 性腺检出率相对较高， 也仅为10.42%，而通过食品安全指数评估结果显示， 养殖河鲀中河豚毒素对食品安全没有影响， 所以目前养殖河鲀的食用是安全的。

（三） 河鲀中河豚毒素安全限量制定的建议河豚毒素是目前世界上备受各国重视的毒素， 欧洲食品安全局 （EFSA） 就海洋双壳类和腹足类动物体内TTX 及其类似物对公共健康的风险发布了科学意见[28]。 根据欧盟现行立法要求 （第853/2004/EC号法规和第854/2004/EC 号法规）， 不得将含TTX的渔业产品投放市场； 而在日本， 制定了 2.2 mg/kg 的监管限量值[29]； 最近 TTX 正式纳入了荷兰鱼类监测计划， 该计划确定了贝类中河豚毒素的安全浓度为44 μg/kg[24]； 我国也开始重视河鲀中河豚毒素的安全限量问题， 但目前缺乏河豚毒素限量标准。

河豚毒素的毒理资料表明， 口服半致死剂量（LD50） 为 232 μg/kg （TTX/ 体重）[27]。 按照该 LD50计算， 不确定系数取100， 如果成年人体重为60 kg， 那么当河豚毒素通过口部摄入量达139.2 μg时就存在安全隐患。 日本厚生劳动省于2005 年发布的 《食品卫生检查指针》 中规定河鲀中的河豚毒素应低于 10 MU/g （约为 2.2 mg/kg）， 我国农办渔〔2016〕 53 号文规定河鲀产品的河豚毒素含量不得超过2.2 mg/kg （以鲜品计）， 中日两国规定值一致。 但由于不同国家对于河鲀的食用方式不同， 其限量的安全性也不同。 比如日本食用河鲀的方式为生鱼片， 且每次限量供应， 这种食用方式决定了每次的食用量有限， 只要每次食用少于20 g， 2.2 mg/kg 的限量是可以保证其食用安全的； 而我国居民的饮食习惯则不同， 每个人每次的食用量有可能会达到400 g[30]， 如果河鲀中河豚毒素含量达到了2.2 mg/kg， 一次性食用 400 g 河鲀可摄入 880 μg的河豚毒素， 超过 139.2 μg 的 6 倍， 所 以 2.2 mg/kg 的限量规定存在很大的安全隐患。 随着养殖河鲀养殖规模和消费需求的扩大， 为了保证人们食用的安全性， 也为了河鲀产业的健康有序发展， 迫切需要建立符合我国实际国情的河豚毒素限量值。

根据河豚毒素的毒理学数据， 急性口服河豚毒素无可见不良作用剂量 （NOAEL） 为 75 μg/kg（TTX/体重）[27]， 成年人平均体重以 60 kg 计， 如果每个人一次最多可以食用1 kg 河鲀， 安全系数取100， 那么安全值为 45 μg/kg， 所以建议河鲀中河豚毒素的限量值定为45 μg/kg。

四、 结论

通过对2015－2021 年养殖河鲀中河豚毒素的数据统计和分析， 发现养殖河鲀中河豚毒素的样品总体检出率为4.81%， 检出值范围为2.28～28.88 μg/kg。 采用食品安全指数对养殖河鲀中的河豚毒素进行暴露评估， 发现肌肉、 皮、 肝脏甚至性腺的食品安全指数均小于0.01 （IFS<<1）， 说明养殖河鲀中的河豚毒素对食品安全没有影响， 所以养殖河鲀的食用是安全的。 随着养殖河鲀产业的发展， 市场对于河鲀的需求会越来越大， 由于缺乏河鲀中河豚毒素的限量标准， 相关监管部门的监管工作会存在很大的障碍， 所以亟需建立符合我国国情的河鲀中河豚毒素的限量标准， 为监管工作提供法律依据， 以保障我国消费者生命安全， 促进产业健康发展。 本文通过对河豚毒素毒理学数据的分析、 讨论及计算， 提出了 45 μg/kg 的限量建议， 为河豚毒素限量标准的制定提供参考。