董 琨 宫晓平 李晓东 郭彦丽 冀 峰 崔璐璐

（1. 张家口市食品药品检验中心， 河北张家口 075000； 2. 岛津企业管理 （中国） 有限公司创新中心，北京 100020）

孔雀石绿 （MG） 和结晶紫 （GV） 均为人工合成的有机化合物， 属于三苯甲烷型的染料， 同时也是杀菌和杀寄生虫的化学制剂， 因价格低廉、 使用方便， 常用于鱼类水霉病等寄生虫病的防治或作为消毒剂用于鲜活鱼类运输过程中， 以延长鱼类的存活时间[1]。 孔雀石绿和结晶紫在生物体内分别代谢为隐性孔雀石绿和隐性结晶紫， 同时还发现孔雀石绿和结晶紫在光照条件下也容易降解[2]。 孔雀石绿、 结晶紫及其代谢物具有高残留、 高毒性、 高致畸和高致癌性， 对人们的健康构成了潜在的威胁[3]。 我国于2002 年已将孔雀石绿列入《食品动物禁用的兽药及其它化合物清单》[4]。

目前， 国家标准中检测水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的方法主要有高效液相色谱（HPLC）法、荧光色谱法和高效液相色谱－串联质谱法等[5～6]，但这些方法的前处理过程繁琐。 超临界流体既有与气体相当的高渗透力和低黏度， 又兼有与液体相近的密度和对物质优良的溶解能力[7]。 近年来， 超临界流体色谱（SFC）法作为一种新的分析技术引起了研究人员的广泛关注[8]。 由于SFC 法使用低黏度的CO2作为主要流动相， 其流速和分离速度均比HPLC法快。 同时， SFC 法仅使用少量的有机溶剂作为流动相的改性剂， 有机溶剂消耗量低于HPLC 法[8]。因此， 与其他色谱技术相比， SFC 技术的分离效率更高、 速度更快、 选择性更好且消耗成本相对较低[9]。 超临界流体萃取（SFE）技术是一种清洁、 高效并且有较好选择性的新型绿色分离方法， 具有高回收率、 低能耗、 无污染、 操作简便等优点[10]。SFE 是国际上最先进的物理萃取技术， 是近代化工分离中出现的高新技术， 其利用超临界CO2优良的溶解力， 实现将基质与萃取物有效分离[11]。 这项技术可以避免有毒有机溶剂的使用、 耗能高及萃取率低等问题， 从而解决传统提取技术导致的诸多问题[12]。 本研究采用在线超临界流体萃取－超临界流体色谱－串联质谱 （Online SFE－SFC－MS/MS）法， 建立了快速测定水产品中孔雀石绿、 结晶紫及其代谢物残留量的分析方法。

一、 材料与方法

（一） 试剂与仪器

1. 标准物质。 孔雀石绿 （纯度 80.0%）、 结晶紫 （纯度 91.6%）、 隐性孔雀石绿 （纯度 96.8%）、隐性结晶紫 （纯度 99.6%）、 氘代结晶紫 （纯度99.7%）、 氘代隐性结晶紫 （纯度 99.2%）， 均购自北京曼哈格生物科技有限公司； 氘代孔雀石绿 （纯度99.8%） 和氘代隐性孔雀石绿 （纯度99.9%） 均购自上海安谱实验科技股份有限公司。

2. 试剂。 乙腈 （色谱纯， 美国Fisher Scientific试剂公司）， 甲醇 （色谱纯， 美国 Fisher Scientific试剂公司）。 超临界流体萃取专用空白滤纸片（Miyazaki Hydro-Protect， 日本岛津公司）。

3. 仪器。 Nexera UC 在线超临界流体萃取/ 超临界流体色谱串联LCMS－8060 三重四极杆质谱仪（日本岛津公司）； Shim-pack UC－X RP C18色谱柱（150 mm×4.6 mm， 3 μm）； CPA225D 型十万分之一精密电子天平 （德国赛多利斯集团）； ME203 型千分之一电子天平 （德国赛多利斯集团）。

（二） 标准溶液的制备

1. 标准品混合储备液的制备。 精密称取孔雀石绿、 结晶紫、 隐性孔雀石绿、 隐性结晶紫标准品10 mg 至100 mL 容量瓶中， 分别加入乙腈稀释至刻度， 摇匀， 制成每1 mL 分别含孔雀石绿、 结晶紫、 隐性孔雀石绿、 隐性结晶紫 100 μg 的溶液，作为标准品储备液。 分别精密量取上述标准储备液各 100 μL 至同一 50 mL 容量瓶中， 用乙腈稀释至刻度， 摇匀， 即得浓度均为200 ng/mL 的标准品混合储备液。

2. 内标混合标准液的制备。 精密称取氘代孔雀石绿、 氘代结晶紫、 氘代隐性孔雀石绿、 氘代隐性结晶紫标准品10 mg 至100 mL 容量瓶中， 分别加入乙腈稀释至刻度， 摇匀， 制成每1 mL 分别含氘代孔雀石绿、 氘代结晶紫、 氘代隐性孔雀石绿、氘代隐性结晶紫100 μg 的溶液， 作为内标标准储备液。 分别精密量取上述内标标准储备液各50 μL至同一50 mL 容量瓶中， 用乙腈稀释至刻度， 摇匀， 即得浓度均为100 ng/mL 的内标混合标准液。

（三） 实验条件

1. 萃取条件。 萃取剂 A 为超临界 CO2， B 为含0.1%甲酸的甲醇， 萃取剂比例为95∶5 （V/V），萃取流速为3 mL/min， 萃取温度为40℃， 萃取时背压 A 为 14.8 MPa， 背压 B 为 15 MPa， 采取先静态萃取4 min， 再动态萃取3 min 的方式进行萃取。

2. 色谱条件。 色谱柱为Shim-pack UC－X RP C18色谱柱 （150 mm×4.6 mm， 3 μm）； 流动相 A为超临界CO2， B 为含0.1%甲酸的甲醇， 流速为2 mL/min， 柱温为 40℃， 采用 5%B （7 min） →30%B（10～15 min）→5%B （15.1～17 min） 的梯度洗脱程序， 洗脱时背压 A 为 15 MPa， 背压 B 为 40 MPa。

3. 质谱条件。 正离子检测模式； 离子源为电喷雾离子源 （ESI）； 离子源温度为 400℃； 脱溶剂管温度为200℃； 加热模块温度为400℃； 雾化气流量为 3 L/min； 加热气流量为15 L/min； 干燥气流量为5 L/min； 其他质谱参数见表1。

表1 多反应监测 （MRM） 扫描模式的参数

（四） 样品制备与测定鱼去鳞、 去皮， 沿背脊取肌肉部分； 虾去头、 壳、 肠腺， 取肌肉部分。均质粉碎均匀 （糊状）， 于－20 ℃保存， 待测。

将待测样品解冻， 准确称取1 g （精确到0.001 g）， 加入 50 μL 同位素内标混合标准液， 使内标最终测定质量为5 ng。 加入超临界流体萃取试剂盒中脱水剂1 包， 搅拌均匀， 放入5 mL 规格超临界流体萃取装置的萃取罐中， 待上机测定。

以超临界状态的CO2为萃取剂， 加入体积分数为5%的含0.1%甲酸的甲醇作为夹带剂， 按照上文的超临界流体萃取条件及超临界流体色谱条件进行萃取、 测定。

二、 结果与分析

（一） 流动相组成对检测结果的影响超临界流体色谱为达到更好的分离效果， 往往要在超临界CO2流体中加入少量的改性剂。 由于乙醇的黏度相对较高， 导致系统压力升高， 长期使用可能会影响色谱柱的使用寿命[13]。 本研究在建立色谱条件过程中考察了超临界CO2－甲醇和超临界CO2－乙腈两种洗脱体系， 用乙腈作改性剂时， 孔雀石绿峰形出现分叉现象 （见图1A）； 用甲醇作改性剂时， 4 种目标物质峰形尖锐对称， 分离效果好， 且响应良好（见图1B）。 最终， 确定甲醇作为改性剂进行梯度洗脱。

图1 不同洗脱体系检测结果色谱图对比

（二） 萃取温度对检测结果的影响温度会对萃取效果产生一定的影响， 一般情况下， 在超临界流体萃取过程中， 萃取效果会随着温度的升高而增强。 在研究中保持其他条件一致， 根据环境温度考察了35℃、 40℃下孔雀石绿、 隐性孔雀石绿、 结晶紫、 隐性结晶紫4 种目标物质的萃取效果， 结果见图 2。 如图 2 所示， 当萃取温度为 40℃时， 4 种目标物质的响应值更高， 因此选择40℃作为最佳萃取温度条件。

图2 不同萃取温度下检测结果色谱图对比

（三） 改性剂比例对检测结果的影响在确定甲醇作为改性剂后， 考察了甲醇在萃取剂中的不同比例对萃取效果的影响， 结果见图3。 研究中保持其他条件一致， 甲醇的体积分数从2%升到5%时，孔雀石绿、 隐性孔雀石绿、 结晶紫、 隐性结晶紫4种目标物质的萃取效果显著增强， 最终将甲醇的体积分数确定为5%来作为改性剂比例的最优条件。

图3 不同比例改性剂的检测结果色谱图对比

（四） 方法的标准曲线线性精密吸取标准品混合储备液 50、 100、 200、 300、 500、 800、 1 000 μL， 用乙腈稀释至 1.0 mL， 摇匀， 配制成系列标准曲线工作液 （10、 20、 40、 60、 100、 160、 200 ng/mL）。 以超临界流体萃取专用空白滤纸片为基质， 放入5 mL 规格超临界流体萃取装置的萃取罐中， 分别精密吸取上述系列标准曲线工作液及内标混合标准液各50 μL 于基质表面， 使内标最终测定质量为5 ng。 按照本研究选取的超临界流体萃取－超临界流体色谱－串联质谱法检测条件进行测定。以峰面积为纵坐标， 标准品质量（ng）为横坐标， 进行线性回归， 得到各组分的回归方程及相关系数（见表2）。 由表2 可见， 方法在试验范围内线性关系良好。

表2 各组分线性关系测定结果

（五） 方法的定量限以空白虾肉样品作基质，称取1.0 g， 用乙腈稀释标准品混合储备液， 取稀释后的标准品溶液及内标混合标准液各50 μL 分别于上述空白基质表面， 混匀， 按照本研究选取的在线超临界流体萃取－超临界流体色谱－串联质谱法检测条件测定， 记录峰面积。 在信噪比S/N 约为10 时测得最低检测浓度为0.5 μg/kg， 即定量限为0.5 μg/kg。

（六） 方法的回收率与精密度分别以空白虾肉和空白鱼肉样品作基质， 称取1.0 g， 分别精密吸取浓度为10、 40、 100 ng/mL 的标准曲线工作液及内标混合标准液各50 μL 于空白基质表面， 使内标最终测定质量为5 ng， 混匀。 按照本研究选取的超临界流体萃取－超临界流体色谱－串联质谱法检测条件提取测定， 将峰面积代入回归方程进行计算加样回收率， 结果见表3。 结果显示， 在0.5～5 ng/g 的加标范围内， 水产品中孔雀石绿、 结晶紫、隐形孔雀石绿、 隐性结晶紫的回收率范围分别为89.7%～97.7%、 96.3%～99.9%、 90.4%～96.8%、94.7%～99.9%， 相对标准偏差（RSD）范围分别为5.3%～7.1%、 4.9%～7.9%、 5.2%～8.9%、 5.7%～6.6%。 Online SFE－SFC－MS/MS 色谱图见图 4。

表3 样品回收率及精密度结果 （n＝6）

图4 样品中孔雀石绿、 结晶紫、 隐形孔雀石绿、 隐性结晶紫的回收率Online SFE－SFC－MS/MS 色谱图 （添加浓度为 0.5 μg/kg）

（七） 实际样品分析应用本研究建立的方法对35 份鱼样品和15 份虾样品中孔雀石绿、 结晶紫及其代谢物进行测定， 仅有1 份样品检出孔雀石绿， 反映出近年来经过有关部门的大力监管， 水产品中孔雀石绿、 结晶紫的使用明显减少， 人民饮食安全得到了较好的保障。

三、 讨论与结论

目前， 国内检测孔雀石绿、 结晶紫及其代谢物的国家标准方法[6]中， 样品在加入内标后， 需用乙腈超声、 匀浆提取两次后再经固相萃取柱净化， 净化液旋蒸后定容方可用液相色谱－串联质谱测定。提取过程还需洗涤匀浆刀头以避免提取过程中的损失， 整个实验过程通常耗费4～5 h， 处理过程繁琐， 耗时较长。 本研究建立了在线超临界流体萃取－超临界流体色谱－串联质谱法来快速自动化检测水产品中孔雀石绿、 结晶紫及其代谢物的残留量， 样品只需简单粉碎后加入脱水剂及内标物即可直接上机， 简化了样品前处理操作， 且整个检测过程仅需要30 min 左右。 同时使用分流阀， 在孔雀石绿、 结晶紫及其代谢物4 种目标物质到达质谱仪之前将部分流动相切换为废液， 通过方法优化， 只将目标分析物送入质谱仪， 从而进一步防止未经净化的样品进入质谱造成污染。

与传统的高效液相色谱法相比， 本研究选用的流动相为超临界CO2和含0.1%甲酸的甲醇。 实验过程中仅加入少量甲醇， 方法具有绿色环保、 试剂成本低的优点。 而在流动相中加入适量甲酸， 可在离子化过程中得到更加丰富的离子碎片信息， 提高测定的灵敏度。 定量方法则采用内标法， 加入稳定的同位素内标物氘代孔雀石绿 （D5－MG）、 氘代隐性孔雀石绿（D6－LMG）、 氘代结晶紫 （D6－CV）、氘代隐性结晶紫 （D6－LCV） 进行校正， 降低了由于超临界萃取过程中4 种目标化合物萃取不充分所带来的偏差， 从而提高了定量测定的准确性， 加标回收率的稳定性和重现性均符合食品理化检测规范的要求。