张程杰

(1.田边三菱制药研发(北京)有限公司上海分公司，上海 200030；2.上海国广生物科技有限公司，上海 201801)

L-茶氨酸(L-theanine, L-The)是一种非常重要的非蛋白质氨基酸，是茶叶中特有的氨基酸，属酰胺类化合物，分子式为C7H14N2O2，占其总游离氨基酸50%以上[1]。L-The使茶叶有鲜美的味道和独特的特色，其在茶叶中的含量会直接影响茶的质量和价格。除了独特的味道，L-The已被证明有许多有益的生理效果，尤其在促进人脑放松，提高注意力和促进学习能力方面有显著的功效[2-3]。L-The已被FDA列为安全的食品药品添加剂。根据数据表明，在2020年我国L-The产量高达700t左右，占据全球总产量的76%以上。随着下游产业的发展，以及L-The应用技术的成熟，近几年全球L-The市场需求持续攀升，行业得到快速发展，L-The的市场需求庞大，需要开发工业化生产L-The途径和方法[4]。

目前，工业化生产 L-The的主要方法有植物分离提取法、植物组织细胞培养法、化学合成法和微生物法。分离提取法生产L-The成本高，规模受到限制，且分离过程中使用大量的化学试剂，易造成环境污染。植物组织细胞培养法运行成本高，无法大规模推广应用。化学合成法得到的是 L-构型和 D-构型的消旋体，需要进一步拆分得到 L-The，且反应副产物多[5]。微生物法催化合成 L-The具有原料价格低廉，催化效率高，立体专一性强等优点，具有大规模工业生产的潜力[6]。但是目前报道的GMAS催化L-谷氨酸和乙胺合成L-The的效率较低，导致L-The产量难以大幅度提高。L-The的化学结构见图1。

图1 L-The的化学结构

GMAS是一种能够催化L-谷氨酸和甲胺合成N-甲基-L-谷氨酰胺的催化用酶，该反应需要消耗ATP。同时GMAS也可以催化乙胺和L-谷氨酸合成L-The。1992年，Kimura等[7]从噬甲基菌株Methylophagasp.中纯化出GMAS，该酶在pH 7.5和40℃条件下有最大活性，表现出较宽的底物特异性范围，并能以乙胺和L-谷氨酸为底物催化合成L-The，但未进行深入研究。2019年，潘鑫茹等[8]报道共表达多聚磷酸盐激酶(PPK)和GMAS的重组菌全细胞催化系统，建立ATP再生系统，强化 L-The的酶法合成。微生物发酵法具有培养条件简单、周期短、操作简便、绿色环保、原料及生产成本低廉等优点，具有更加良好的工业应用价值。本研究建立了GMAS的三维结构，通过分子对接，开展GMAS的晶体结构半理性设计，建立GMAS关键位点的饱和突变体库，以提高GMAS对关键底物谷氨酸的催化效率。

1 材料与方法

1.1 菌种与试剂

E.coliBL21(DE3)菌株，质粒pETDuet-1为本实验室保存。质粒pETDuet-1-GMAS-PPK和基因工程菌BL21(DE3)/pETDuet-1-GMAS-PPK由本实验室构建。L-谷氨酸、乙胺和L-The均为分析纯。

1.2 大肠杆菌合成L-The

将质粒pETDuet-1-GMAS-PPK转化到BL21(DE3)中，构建合成L-The的基因工程菌BL21(DE3)/pETDuet-1-GMAS-PPK。将单菌落接种到培养基中，待OD600达到0.5-0.6，加入1.0 mM IPTG, 5 g/L L-谷氨酸，5 g/L 乙胺盐酸盐，250 RPM, 30℃, 发酵48 h。

1.3 同源模建及分子对接

选择源于Methyloversatilisuniversalis的GMAS的晶体结构为模板，运用Swiss-Model服务器建立GMAS的三维模型。使用AutoDock4.2软件进行分子对接。采用AutoDockTools程序简历格点盒子，格子长宽高位置为4 nm，间隔0.375?，采集128个构象。通过拉马克遗传算法将全局和局部搜索的能量优化结合，寻找配体与受体最佳结合位置，完成分子对接。采用PyMOL软件分析对接后复合物的三维结构。

1.4 饱和突变文库的构建和筛选

基于GMAS一级结构和三维结构分析，选择在GMAS的E174位点进行饱和突变。设计含有简并密码子 NNK( N = A /T/C/G，K = G/T) 的引物，以重组质粒pETDuet-1-GMAS-PPK为模板，利用PCR方法 (PCR反应条件: 98℃变性60 s; 98℃预变性 30 s，55℃退火 15 s，72℃延伸7 min，30个循环; 72℃充分延伸5 min; 16℃保存) 进行饱和突变以构建突变文库。通过Sanger公司(上海)测序，确定正确的突变体。挑取正确的转化子接种到含有 2 mL LB液体培养基的玻璃试管中，于 37℃，200 r/min 条件下培养 8 h 后，转接至含有 10 mL LB 液体培养基的100 mL锥形瓶中，37℃，200 r/min 条件下培养至 OD600为 0. 6-0. 8，向培养基中添加0. 5 mM IPTG，不同浓度的L-谷氨酸和乙胺，于30℃，200 r/min条件下诱导培养 12 h。通过高效液相色谱法测定L-The产量。

1.5 分析方法

L-谷氨酸和L-The用高效液相色谱法进行定性和定量分析。衍生剂采用苯异硫酸酯[9]，XDB-C18柱，操作温度40℃，流速1.0 mL/min， 检测波长254 nm。

2 结果与分析

2.1 GMAS与L-谷氨酸的模建结构与分子对接

位于酶底物结合口袋附近的氨基酸突变通常会在一定程度上影响酶的空间结构、电荷分布及疏水性，从而影响酶的催化活性和底物专一性等催化特性[10]。选取Methyloversatilisuniversalis的GMAS的晶体结构为模板建立了 GMAS 的三维模型，并将底物对接到建立好的三维模型中，对接结果见图2。结构生物学数据表明，GMAS的底物结合口袋相对保守，推测口袋内识别底物谷氨酸和乙胺的关键氨基酸残基为E174。通过在线服务器SWISS-MODEL对GMAS中缺失的结构进行同源模建补全，然后进行分子对接。GMAS与L-谷氨酸的模建结构与分子对接结果见图2。

图2 GMAS与L-谷氨酸的模建结构与分子对接

2.2 E174位点饱和突变对合成L-茶氨酸的影响

利用含有简并密码子的引物进行E174位点饱和突变以构建突变文库，获得了库容20 株的突变文库。结果显示，突变体E174A、E174R、E174C、E174E和E174S与野生型E174在L-The产量上无显著性差别，而突变体E174A和E174G在L-The产量上相较野生型，提高了19%和24%。摇瓶发酵24 h，L-The产量达到1.71 g/L和1.78 g/L(图3)。其他饱和突变体导致L-The产量现在下降。E174A和E174G这两个突变体明显提高了L-The在大肠杆菌中的合成能力，实现了L-The产量的大幅提高。

图3 突变体E174A和E174G提高大肠杆菌L-The产量

3 讨论

L-The是茶树中最具代表性的非蛋白氨基酸，是茶叶的鲜味成分之一，有助于茶的独特风味。由于其多种保健功能，L-The已被商业开发为一种有价值的成分，被广泛用作食品补充剂和添加到药物、保健品和化妆品中。微生物发酵法生产L-The具有一步完成反应、原料价格低廉、容易从反应液中提取获得产物、转化效率高、可大量生产等特点，因此，采用微生物发酵法是实现L-The规模化生产的潜在优势途径。为了提高GMAS的在大肠杆菌中的表现，过表达构建的GMAS的 E174 位点饱和突变体，希望获得在大肠杆菌胞内表现更好的GMAS，经过发酵后，发现 GMAS (E174A) 和GMAS (E174G)的点突变，显著提高了大肠杆菌合成L-The的产量，这证明了 E174位点对 GMAS 的重要性。