★ 马梅芳 侯惺 李凡 赵林涛 李芳（.枣庄市食品药品检验检测中心 山东 枣庄 770；.枣庄市立医院 山东 枣庄 7700；.陕西省中医药研究院 西安 70068）

蛋白质分子是体现生命活动的特征性物质，在不同的生物种属间存在差异，受遗传基因的控制，具有遗传的稳定性［1］。日本学者研究发现，蛋白质的谱带序列具有生物种的特征，并在生物的分类学研究中，成功地应用了蛋白质的电泳技术［2］。蛋白质分子分为同工酶和贮藏蛋白两大类，不同蛋白质分子的分子量大小、电荷数目、电荷极性以及空间结构都具有差异，是进行电泳分离的基础。中药体内的同工酶、贮藏蛋白等大分子物质携带有各种遗传性信息，中药品种的遗传特性，可以直接或间接通过聚丙烯酰胺凝胶电泳的检测结果反映出来，利用这种生物学方面的差异，可将蛋白质电泳技术用于中药物种的鉴定。

自上世纪80年代初，石俊英教授等率先将电泳技术引入到中药的鉴别研究中，与现代生物技术的结合与运用，为传统中药学科的发展注入新的活力，中药的质量评价手段和技术也从手摸、眼看、鼻闻、口尝等传统的性状控制逐渐发展到显微鉴别、组织形态分析、细胞培养以及蛋白质分子水平。在蛋白质电泳原理的指导下，经过研究人员大量的实验探索，建立了“中药电泳鉴别法”这项新技术，并将之广泛应用于各类中药的鉴别研究中［3-11］。近年来，“指纹图谱”概念的提出，为中药的研究指出新的方向，将蛋白质电泳技术与“指纹图谱”思路相结合，提出的“中药电泳指纹图谱”新理念，将中药鉴别研究再一次提高到生物指纹图谱水平，摆脱了蛋白质之外的其它因素的干扰和制约，实现了中药鉴定手段的跨越。本实验采用聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法对南葶苈子、北葶苈子及其伪品的蛋白质、同工酶进行分析测试，绘制葶苈子的蛋白质电泳指纹图谱，丰富和完善葶苈子的质量控制研究内容。

1 仪器与试药

电子天平(BS-224S型，德国赛多利斯公司)；稳流稳压电泳仪及电泳仪槽（DYY-Ⅲ型，DYY-Ⅲ28型，北京六一仪器厂）；高速冷冻离心机（LGR16-W型，北京医用离心机厂）；凝胶成像紫外分析仪（EDAS-290型，北京市新技术应用研究所）；真空泵（AVP-7120型，梅瑞泰克科技）；真空干燥器（DZF6050型，上海精宏实验设备有限公司）；超声提取器（JBT-QX500F型，济宁金白特电子有限责任公司）；一次性注射器（江苏正康医疗器械有限公司）；微量进样器（上海安亭微量进样器厂）。

四甲基乙二胺（TEMED）（天津大茂化学试剂有限公司）；过硫酸铵（天津博迪化工股份有限公司）；琼脂（上海精细化工有限公司）；蔗糖（上海精细化工有限公司）；考马斯亮蓝（上海国药集团化学试剂有限公司）； 分离胶贮液、浓缩胶贮液、分离胶缓冲液（pH8.9）、浓缩胶缓冲液（pH6.7）、电泳缓冲液（pH8.3），按照《中国药典》2015年版四部规定的方法新鲜配制。

山东威海9个2019年的葶苈子样品，经山东中医药大学石俊英教授鉴定为十字花科植物独行菜Lepidium apetalumWilld.的种子（北葶苈子，编号1~8）和十字花科植物播娘蒿Descurainiasophia（L.）Webb ex Prantl.的种子（南葶苈子，编号9）；山东威海3个2019年的葶苈子伪品，经山东中医药大学石俊英教授鉴定为十字花科植物荠 菜Capsella bursa-pastoris（L.）Medic.的 种 子（编号10）；十字花科植物喜山葶苈Draba oreadesL.的种子（编号11）；十字花科植物北美独行菜Lepidium virginicumL. 的种子（编号12）。

2 方法

2.1 供试品溶液的制备

称取样品1.0 g，置冰浴研钵中，控制低温研磨粉碎，加入pH8.9浓缩胶缓冲液（用前稀释4倍）1 mL，超声提取30 min（冰浴控制提取温度），冷冻离心2 min（0 ℃，8 000 r/min），取上清液，与相同体积的蔗糖溶液（浓度40%）混匀，置4℃冰箱内，备用。

2.2 电泳槽的安装

为降低氧对聚丙烯酰胺聚合反应的抑制作用，实验选择垂直板电泳槽，电泳槽双平板为封闭环境，灌胶后，除顶层部分凝胶外其他均与空气隔绝，减少与氧的接触。垂直板电泳槽样式繁多，目前流行的是有机玻璃材质的，呈方形或长方形，由两个半槽组成，在硅酮橡胶的夹套内装入两块玻璃即构成凝胶模子，凝胶模子设计在两个半槽之间，用来装电极缓冲液的正负两个槽在模子的两侧。

实验前玻璃板按照洗液或去污剂浸泡清洗、水冲洗、蒸馏水冲洗的顺序处理干净，直立干燥，注意已经洁净的玻璃板面不要被手接触污染。安装时，用双手控制玻璃板的两侧边缘部分，先把玻璃板装入夹套，再整体放入两个半槽之间（注意保持角度的垂直），先固定长螺杆，再按照顺序，拧紧各个螺丝（注意用力要均匀）。

安装好电泳槽后，将琼脂加热熔化，缓缓倒入电泳仪底槽内，凝结成约5 mm厚的琼脂层封底。

2.3 凝胶的制备

按表1的比例配制3%浓缩胶液4 mL、7%分离胶液16 mL。将配好的2种胶液置真空干燥器内抽真空处理10 min，以降低氧对聚合反应的抑制作用。分离胶液，缓缓注入已安装好的凝胶模子中，待胶液稍凝后，在表层覆盖约1 mm厚的分离胶缓冲液，静置1 h以上，液面分层后，用滤纸条吸净水层。插上上样槽模具，将浓缩胶注入凝胶模子中，静置，待浓缩胶变为乳白色时，取出上样槽模具。立即向电泳槽内加入电泳缓冲液。

表1 电泳凝胶的配制

2.4 上样与电泳

浓缩胶凝固后应上样，上样量20 μL，在负极槽电极缓冲液中加入一滴溴酚蓝指示剂用来示踪，电泳开始时电流保持15 mA，待样品进入分离胶后，调整电流至25 mA。待示踪指示剂行至距琼脂层约1 cm时，关闭电源，停止电泳。

2.5 染色与脱色

2.5.1 蛋白质染色与保存 电泳结束后，取出胶板，标记前沿。将凝胶板浸于考马斯亮兰染色液内，在37 ℃染色1~2 h，至谱带清晰。用蒸馏水洗去凝胶表面附着的染料，再浸于脱色液中脱色，直至谱带背景清晰。保存于7%醋酸溶液中。

2.5.2 同工酶染色与保存 电泳结束后，取出胶板，标记前沿。将胶板浸于醋酸联苯胺染色液中，加30%双氧水2~3滴，常温下染色，很快出现蓝色谱带，不久谱带变为棕红色，弃去染色液，凝胶板用蒸馏水冲洗后保存于7%的醋酸溶液中。

3 结果

3.1 蛋白质及同工酶电泳结果

样品蛋白质电泳结果见图1，样品同工酶电泳结果图2。

图1 样品蛋白质电泳图谱

图2 样品同工酶电泳图谱

3.2 电泳图谱分析

通过“凝胶成像系统” （Image Analysis）将脱去底色的凝胶板扫描成PAGE图谱，然后经“Advanced American Biotechnology” (AAB)系统分析后即得到以各谱带的光密度值（OD）为纵坐标、谱带泳动距离（Pos）为横坐标的电泳图谱，结果见图3、图4。

图3 样品蛋白质电泳图谱分析

图4 样品同工酶电泳图谱分析

3.3 相似度分析

样品蛋白质电泳相似度分析结果见图5，样品同工酶电泳相似度分析结果见图6。

图5 样品蛋白质电泳相似度分析图

图6 样品同工酶电泳相似度分析图

3.4 聚类分析

样品蛋白质电泳聚类分析结果见图7，样品同工酶电泳聚类分析结果见图8。

图7 样品蛋白质电泳聚类分析图

图8 样品同工酶电泳聚类分析图

4 讨论

（1）由葶苈子的蛋白质电泳图谱可知：相同产地、不同生长环境的8个独行菜种子样品的蛋白质电泳图谱条带无差异，说明8个独行菜种子样品中存在相同种类的蛋白质；独行菜种子与播娘蒿种子、荠菜种子、喜山葶苈种子、北美独行菜种子相比，则差异较大。由蛋白质电泳指纹图谱相似度与聚类分析的结果可以看出：相同产地、不同生长环境的独行菜种子中含有的蛋白质种类相同，含量近似。生长环境对独行菜种子中蛋白质种类无影响，对蛋白质含量影响不大。独行菜种子与播娘蒿种子、荠菜种子、喜山葶苈种子、北美独行菜种子相比，蛋白质种类与数量均有较大差异。

（2）由葶苈子的同工酶电泳图谱可知：相同产地、不同生长环境的8个独行菜种子样品的同工酶电泳谱带位置相同，说明8个独行菜种子样品中含有的相同种类的同工酶。由同工酶电泳指纹图谱相似度与聚类分析的结果可以看出：相同产地、不同生长环境的独行菜种子中含有的同工酶种类相同，含量极为近似。独行菜种子与北美独行菜种子相比，同工酶种类与数量具有一定的相似性；独行菜种子与播娘蒿种子、荠菜种子、喜山葶苈种子相比，同工酶种类与数量均有显著性差异。

（3）蛋白质分子普遍存在于植物细胞内，是基因表达的产物，受遗传基因的控制而不受地理位置、生长环境、种植采收等众多外界因素的影响，具有种的特异性和稳定性。因此，不同的植物品种、杂交种会表现出不同的电泳谱带模式，可以区分。独行菜、北美独行菜均来源于十字花科独行菜属，播娘蒿来源于十字花科播娘蒿属，喜山葶苈来源于十字花科葶苈属，荠菜来源于十字花科荠菜属，其蛋白质电泳指纹图谱的差异表明：蛋白质电泳指纹图谱不仅可以用于不同科属间正品、伪品的鉴别，而且可以解决同科同属不同种间正品、伪品不易区分的难题。而同工酶指纹图谱在品种的鉴定上更加准确、稳定，因为同工酶的结构差异主要来源于基因差异，利用它可以鉴别诸多基因变异，如生物的类别、品种的地理分布、演化关系等［12］。8个独行菜种子样品的同工酶电泳谱带位置相同，表明不同的生长环境没有引起独行菜的品种退化。12个样品同工酶电泳指纹图谱相似度与聚类分析的结果提示：与播娘蒿、荠菜、喜山葶苈相比，北美独行菜与独行菜的亲缘关系更近一些，此结果与植物分类学的研究一致。

（4）本实验建立了葶苈子的蛋白质、同工酶电泳指纹图谱，把聚丙烯酰胺凝胶电泳结果中各谱带的位置、宽度及每条谱带中蛋白质、同工酶含量的大小都进行了量化，进一步增加了中药电泳的准确度。聚丙烯酰胺凝胶电泳具有分析灵敏度高、实验材料用量少、结果重现性好，分析过程受环境因素影响小，对样品形态、来源适应性强等诸多优点。针对目前葶苈子品种来源复杂多样、内在质量难以评价、鉴定困难等难题，电泳技术的灵敏、准确、分析效率高、速度快等优点表现出独特的优势。葶苈子蛋白质、同工酶电泳指纹图谱的建立，再次证明了以蛋白质分子为标示，从分子水平上进行中药的鉴定与质量评价，是完全可行的。