李玉岭，闫少波，毛秀红，王翠艳，王金娜，刘翠兰，张 谦，乔艳辉

（1山东省林业科学研究院，济南 250014；2鲁担（山东）城乡冷链产融有限公司，济南 250010；3青岛市即墨区蓝村街道办事处，山东青岛 266231；4龙口市园林建设养护中心，烟台 265701）

0 引言

多倍体在生物界中普遍存在，是指体细胞内含有3套及3套以上染色体组的个体，尤其在高等植物中较常见，根据染色体组来源不同，分为同源、异源多倍体[1]。在木本植物中，裸子植物的多倍体相对较少，而被子植物多倍体比较多[2]。多倍体一般在生长速度、品质及代谢产物方面有较强的优势，具体表现为巨大性、抗性增强、可孕性低、代谢产物增加等。1935年发现首棵天然的三倍体欧洲山杨(2n=3x=57)，被认为是林木多倍体育种的开始[3]，从此在林木中展开多倍体育种。红花七叶树是最早育成的林木多倍体[4]，它是由同是二倍体的欧洲七叶树和美国七叶树杂交，后加倍产生的异源四倍体。林木生命周期长、个体较分散，细胞遗传学研究相当困难，大多数树种的染色体变异情况仍然未知，因此进行人工诱导林木多倍体成为育种者更加迫切而有意义的任务。

人工诱导多倍体可采用物理、化学和生物诱导方法，其中最常用有效的是化学诱导。化学诱导主要是利用化学药剂进行多倍体诱导，药剂主要有秋水仙素、异生长素、萘嵌戊烷、植物碱、甲基磺酸乙酯、水合三氯乙醛、氧化亚氮、富民隆（对甲苯砜苯胺基苯汞）[2]等。而秋水仙素是使用最广泛和有效的一种诱导剂，它通过抑制细胞分裂中期纺锤体的形成，阻碍微管形成和染色体向两级移动，使细胞核中的染色体加倍而形成多倍体。最重要的是秋水仙素对染色体结构并无显著影响，遗传上发生不利变异的概率很小[5]。1937 年，Blakeslee等[6]用秋水仙素成功诱导曼陀罗等植物染色体数加倍，自此，秋水仙素便被作为培育植物新品种的主要诱变剂。林木方面，目前秋水仙素已在杨树[7-8]、刺槐[9]、尾叶桉[10]、悬铃木[11]、蒙桑[12]、青檀[13]、杜仲[14]等树种上成功诱导出多倍体植株。秋水仙素在林木多倍体诱导上取得了一些成绩，但此方面较新的综述评论文章少，系统认识和了解此领域有一定的困难。笔者总结近年秋水仙素在林木多倍体上的研究进展，重点对秋水仙素诱导林木多倍体的影响因素、多倍体鉴定方法及存在的主要问题进行阐述，以期为林木多倍体的深入研究提供理论参考。

1 秋水仙素诱导林木多倍体技术

1.1 诱导方法

根据诱导材料的不同，秋水仙素诱导多倍体包括活体诱导和离体诱导2种方法。活体诱导是指将萌发的种子、幼苗、芽、胚根、生长点、花蕾等分裂旺盛的组织作为诱导材料进行诱导，处理方法包括浸泡法、滴液法、注射法等。活体诱导效率低，易产生嵌合体并发生回复突变[15]。离体诱导处理方法主要有浸泡法、混培法、滴定法等，诱导材料包括种子、茎段、丛生芽、愈伤组织、叶片、胚、原生质体等[16]。离体诱导条件易控制，重复性强，诱导效率较高，嵌合体发生率低。

1.2 秋水仙素诱导林木多倍体的影响因素

1.2.1 秋水仙素浓度及时间 秋水仙素诱导多倍体，浓度是非常关键的因素。当达到一定的浓度，秋水仙素才能有效诱导多倍体发生，但随着浓度的增加，植物的死亡率也明显升高。一般比较有效的秋水仙素浓度范围为0.0006%～1.6000%[17]。因此，秋水仙素最佳诱导浓度的探索尤为重要，一般认为，诱导浓度达到半致死率时，诱导效率较高[18]。冯玥等[19]用质量分数0.4%的秋水仙素浸泡刺槐种子，诱导效率最高。研究发现，桉树外植体用质量分数0.05%～0.5%的秋水仙素诱导处理2～12 天，共产生6 株四倍体，而最有效的秋水仙素浓度为0.5%[20]。

除秋水仙素浓度外，诱导时间也非常重要，处理时间不足，细胞的有丝分裂无法同步进行，易产生嵌合体；处理时间过长，诱导材料受秋水仙素毒害大，易死亡。因此，处理浓度和时间是影响多倍体发生最重要的2 个因素，应设置浓度和时间梯度，探索最优组合。如利用茶树腋芽进行多倍体诱导，采用3%的琼脂套包裹质量分数0.3%的秋水仙素处理腋芽4 天，诱变效果最佳，诱变率为40%[21]。用质量分数0.25%的秋水仙素处理尾叶桉的花蕾（花蕾所处时期为首次观测到小孢子发生细线期7 天后）6 h，三倍体诱导效率最高，为6.25%[10]。以杉木种子进行秋水仙素诱变，发现质量分数0.9%的秋水仙素浸种4天为获得高突变体的最佳组合[22]。用质量分数0.5%的秋水仙素溶液处理桉树3.5～4.0 mm的花芽6 h，2n花粉产量最高，达28.71%[23]。柑橘多倍体体外诱导表明，用质量分数0.1%秋水仙素处理柑橘种子48 h，四倍体诱导效率最高[24]。白皮松的成熟胚的子叶进行预培养10天后进行诱导，显示质量分数0.03%的秋水仙素诱导12 h，多倍体诱导率最高，达到40.5%[26]。大青杨三倍体诱导试验中，用质量分数0.5%的秋水仙素溶液浸泡授粉36～60 h 的雌花序24 h，诱导效果最好[27]。近年来秋水仙素诱导林木多倍体的实例很多，详细可见表1。

表1 秋水仙素诱导林木多倍体的研究进展

1.2.2 秋水仙素处理方法 秋水仙素处理方法有浸泡法、滴液法、涂抹法、注射法、混培法等，不同的试验材料需要不同的处理方法，在实际试验中根据诱变材料灵活选择合适方法才能达到理想诱导效果。

（1）浸泡法。将诱导材料直接浸泡在一定浓度的秋水仙素中，此方法操作简便，能使药液充分接触材料，细胞分裂同步程度高，降低嵌合体的发生率，但处理时长应该适当，以免对诱导材料造成损害。浸泡法用途广泛，材料可为花序、种子、幼苗等。银腺杨和毛白杨杂交授粉后24～36 h 用秋水仙素浸泡花序，得到21 株三倍体[28]。以小青杨和北京杨为父本，用其花粉对‘哲引3 号’杨授粉，授粉完成后用质量分数0.3%～0.5%秋水仙素浸泡雌花序，得到青杨杂种三倍体[29]。樟树的种子采用浸泡法，在秋水仙素质量分数0.8%和1.0%溶液浸泡48 h，诱导率分别为22.0%和20.6%，分别诱导出11棵和7棵四倍体[30]。石佳等[31]利用南高丛越橘组培苗进行多倍体诱导，分别采用浸泡法和培养基添加法（混培法），结果表明浸泡法的诱变效果优于培养基添加法，用质量分数0.1%的秋水仙素浸泡越橘茎尖24 h，四倍体植株率为6.67%。同理，利用浸泡法对不同萌发天数的木槿种子进行诱变，表明以质量分数0.20%的秋水仙素处理胚根萌发天数为2 天的木槿种子12 h，成苗及诱变效果最佳[32]。

（2）滴液法。将蘸有药剂的脱脂棉包裹在植物材料表面，每天滴一至数次药剂，以脱脂棉不滴落药剂为标准。该方法操作简便，药剂用量少，不需损伤植物体，便于恢复，试验周期短。将蘸有不同浓度秋水仙素的脱脂棉包裹在青檀幼苗的茎尖生长点上，结果显示质量分数0.4%～0.8%的秋水仙素处理3 天效果最佳，诱变率达34.2%[13]。同样方法处理杜仲幼苗生长点，最佳处理是质量分数0.1%的秋水仙素处理12 h，变异株率和四倍体株率分别为63.3%和36.7%[14]。而用浓度为6 mg/mL的秋水仙素处理紫株茎尖生长点48 h效果最明显，形态变异率可达40.83%[33]。

（3）注射法。将药剂用注射器注射到待处理部位，该法高效便捷、给药精准。但注射的药剂量是有限的，并不能保证达到所需剂量，注射中会造成一定的损伤，也会影响诱导效果。注射法适用杨树2n花粉和2n大孢子的诱导[35]。如对发育至粗线期的银灰杨花粉母细胞，用质量分数0.5%的秋水仙素进行11 次注射处理，2n 花粉平均诱导率最高可达30.27%±8.69%[36]。用质量分数0.3%的秋水仙素注射水培4 天的大青杨雄花枝，2n 花粉诱导率最高[37]。同理，用质量分数0.5%的秋水仙碱对发育至细线末期到粗线期的银白杨花粉母细胞进行7 次注射处理，2n 花粉比例最高可达82.33%[38]。然而用质量分数0.6%的秋水仙素每隔2 h注射，共注射4次，杨树2n花粉诱导率可达62.10%，但仅成功诱导2个三倍体[40]。

（4）混培法。该法是将诱导材料接种在附加有秋水仙素的培养基上，诱导完成后转入无秋水仙素的培养基中进行再培养，此法适合离体材料诱导。西南林业大学以滇杨叶柄为材料，采用秋水仙素结合组织培养法诱导滇杨多倍体，结果显示秋水仙素浓度为80 mg/L 处理30 天或90 mg/L 处理20～30 天为较优组合，多倍体诱导率最高达16.18%[41]。胡杨叶片外植体预培养6 天后，加入到含50 μmol/L 的秋水仙素MS 培养基培养3 天，诱导四倍体效率最高，可达14.6%[42]。毛泡桐的胚性愈伤组织在含不同浓度秋水仙素的MS培养基上诱导，最佳组合为0.05%的秋水仙素处理48 h，产生100多株四倍体[43]。

1.2.3 其他影响因素 除上述因素外，光照、温度、化学渗透剂、震荡、诱导材料及其所处发育时期都会影响诱导结果。其中光照条件是影响多倍体诱导效果的重要因素，研究得知黑暗条件下更有利于多倍体诱导[44]，这与秋水仙素见光容易分解是一致的。化学渗透剂二甲基亚砜(DMSO)可以促进秋水仙素对细胞的渗透，提高秋水仙素的诱导效果并降低嵌合体的发生率[45]。但渗透剂使用量应控制好，过多会使外植体受毒害，一般使用量为1%～4%即可。

在秋水仙素浸泡外植体的时候，配合震荡处理可使药剂和外植体充分接触，更好促进诱变。有人研究了摇床、渗透剂对巨尾桉多倍体诱导的影响，表明使用摇床和渗透剂可以在秋水仙素较低浓度、处理时间更短的情况下达到最佳诱导率[46]。

同一植物的不同器官，诱导结果也不尽相同。枇杷的茎尖、幼苗和未发芽种子同时用不同浓度的秋水仙素处理，枇杷茎尖和幼苗均未产生多倍体，而未萌发的种子经质量分数0.5%的秋水仙素处理24 h和48 h，分别产生2株三倍体植株和1株四倍体植株[48]。另外，同一器官处于不同生长时期，也会造成诱导率的不同。

2 多倍体的鉴定方法

多倍体的鉴定方法有很多，有直接鉴定法（染色体计数法）、间接鉴定法（如通过植物生长形态特征、气孔大小和密度、叶绿体的数量以及流式细胞仪测定DNA含量等）。在实际鉴定中，采用多种方法互相验证，才能更加准确。

2.1 形态学鉴定

植物外部形态直观，容易辨别鉴定。多倍体植株呈现“巨大性”，如茎较粗壮，叶片变厚变大，叶形指数减小，叶色更深绿，花颜色深邃，花冠、果较大等。但不排除多倍体有生长矮小和缓慢的可能性，如在同样的生长环境下36 个月，桉树四倍体比二倍体生长缓慢，植株矮小[20]。秋水仙素处理容易引起植株早期生长的畸变，所以生长前期仅靠形态特征鉴定多倍体是不可行的。

2.2 染色体计数法

染色体计数又称直接鉴定法，是植物倍性分析最直接最准确的方法。染色体计数法又包括常规压片法和去壁滴渗法2 种。常规压片法一般以根尖、茎尖及花粉母细胞作为材料，经醋酸洋红、苏木精或其他染色剂进行染色压片，然后利用显微镜观察细胞分裂中期的染色体数目[54]。该方法缺点是步骤繁琐，对试验条件和操作水平要求高、工作量大。而去壁滴渗法则是用荧光显微镜和DAPI染色相结合的一种染色体制片法，该法适用于很多木本植物，准确高效[55]。

2.3 细胞水平鉴定

根据植物的气孔大小和密度、叶绿体数量等可以初步判别其倍性，提高鉴定效率。多倍体植物表皮的气孔保卫细胞明显增大，而密度减小；有研究认为气孔大小和密度可以作为二倍体和四倍体分化的标记[56]。多倍体保卫细胞内叶绿体颜色深，数量增多；如二倍体和四倍体茶树的保卫细胞叶绿体数目差异达到极显著水平(t=27.34)，且两者比例与其染色体数目之比一致[21]。多倍体花粉粒体积增大，有的呈畸形，可孕性降低。

2.4 流式细胞术

流式细胞仪应用在植物倍性鉴定上越来越多，其优势是能快速检测大量样品且分析不同组织的倍性[57]。该方法是利用DNA 相对含量与其倍性水平存在正相关性，测定细胞内DNA 含量即可鉴定植株倍性[58]。而且对材料没有特殊要求，在植物生长发育的前期即可鉴定。但此方法价格昂贵，检测费用高，并且只能准确鉴定出同质多倍体的数目，不能鉴定未知染色体数目植物的染色体数，需要结合染色体计数法进行鉴定。再者无法确定异源多倍体、有性杂交得到的多倍体的染色体来源[54]。

2.5 其他鉴定方法

有研究指出，染色中心数目与植株的倍性存在正相关性，可以根据染色中心数目最大值判断植株倍性。如对‘哲引3号杨’ב北京杨’F1代的研究发现，当间期细胞核染色中心数目大于40时,可初步判断该植株为三倍体[59]。另外，随着分子生物学的发展，分子标记（RFLP、AFLP、SSR等）、指纹图谱、基因组原位杂交(GISH)、荧光原位杂交(FISH)等技术可对植株进行倍性鉴定[60]，目前在果树上应用较多。

3 存在的问题及解决策略

3.1 嵌合体的鉴别分离和纯化

细胞发育存在不同步性，经秋水仙素诱导后，有些细胞变成多倍体（三倍体、四倍体、六倍体等），有些没有变化，如何筛选出所需要的多倍体仍是一个难题，这需要高效的初筛方法，如流式细胞术、分子标记等。同时根据林木可无性繁殖的特点，在生长早期对嵌合体中的诱变部分进行剥离，通过各种无性繁殖手段将多倍化性状纯化固定。另外，离体条件下嵌合体的分离通常采用组织连续切割分离法和叶片不定芽再生法[61]。如对越橘嵌合体进行切芽分离和再诱导，获得了四倍体越橘[31]。嵌合体的分离纯化费时费力，而采用细胞悬浮液、单细胞起源的胚状体或愈伤组织为诱变材料，可以有效减少嵌合体的产生，提高多倍体纯合体的比例。如用秋水仙素诱导桠柑胚性愈伤组织，通过细胞悬浮培养技术获得了柑橘的同源多倍体，无嵌合体产生[62]。秋水仙素诱导柑橘愈伤组织也获得了四倍体植株[63]。同理，枣树的愈伤组织进行秋水仙素诱导，培养出四倍体植株，且有效避免了嵌合体的产生[64]。

3.2 秋水仙素替代品的开发

秋水仙素在多倍体诱导中效率较高，但其价格昂贵且对生物体有强毒害作用。如秋水仙素诱导悬铃木的种子，诱变率高达40%，但由于秋水仙素的毒害作用，胚根伸长被抑制，根毛很少形成，幼苗均没有成活[11]。因此寻找价格合理和无毒副作用的替代品是当务之急。相对于秋水仙素，氟乐灵、氨磺灵和甲基胺草磷等除草剂对微管蛋白二聚体的亲和性更强，诱变率更高，且无毒、经济成本更低[16]。氟乐灵、秋水仙素和氨磺灵在毛茛上的诱变试验表明，氟乐灵诱导率最高(27.5%)，秋水仙素次之(23.3%)，氨磺灵最差[65]。另有研究发现，杨树花粉染色体加倍效果最好的药剂是戊炔草胺[66]。因此，研究开发高效无毒、低成本的多倍体诱导剂将很有前景。

3.3 林木多倍体性状评价周期长

林木不仅存在生长周期长、受环境影响大的特点，而且林木的染色体数一般相对较多，不易进行染色体加倍。再者通过染色体加倍获得的林木多倍体植株，需要经过多年无性系的观察测定，根据预期的育种目标多代选择，其优良性状才能被认可确定。目前林木多倍体在生产和应用推广上不足，仅苹果、葡萄、柑橘等果树和桑树、毛白杨有多倍体推广应用的报道[67-69]。因此需要育种工作者长期坚持，扩大诱变树种的种类，选择出更多适应生产且效益显著的多倍体树种。

3.4 同源多倍体分子机理研究不足

异源多倍体不仅会导致植物基因组大小和基因结构的改变，还影响基因表达模式，如DNA 甲基化模式发生改变、基因沉默和基因激活等[70]。相比之下，秋水仙素诱导的同源多倍体基因组大小及基因表达研究相对较少。同源加倍后基因组变化无明显规律，有的与亲本基因组加和无显著区别，有的与亲本基因组加和相比出现缩减，出现后者的原因可能是同源加倍后存在序列删除现象[71]。同源多倍化后会出现基因表达上调或下降的现象，但这只是出现在部分基因中且表达变化范围有限[72]。因此，同源多倍体基因组大小和结构的改变模式尚不清楚，同源多倍化后基因表达调控的机理还有很多空白，沉默和激活基因的机制也不明确，对同源多倍体分子机理的研究有待进一步加强。