王得慧，王灿，武世奎*，王英泽，王敏杰，王敏，张燕芳

1.内蒙古医科大学 药学院，内蒙古 呼和浩特 010110；

2.河北科技大学 生物科学与工程学院，河北 石家庄 050018

在食品和药品中汞（Hg）元素有严格的限量要求[1]，但一些含汞矿物，如朱砂、孟根乌苏等在传统医药中可作为药品使用，并且对一些难治疾病有独特疗效[2]。在蒙古族药（以下简称蒙药）中，孟根乌苏及其复方制剂孟根乌苏-18 味丸（以下简称18 味丸）具有燥“协日乌素”的独特功效。“协日乌素”可直译为黄水病。蒙古族医（以下简称蒙医）认为，黄水病是由黄水失衡、功能紊乱引起的以局部肿胀、疼痛、流黄水、瘙痒为临床特征的疾病，主要指牛皮癣、类风湿性关节炎等自身免疫性疾病[3]。18 味丸是含孟根乌苏复方制剂中最具代表性的制剂之一，为消除黄水病之良药[4]。佟海英等[5]对18味丸治疗效果进行分析，结果表明，其治疗风湿性关节炎有效率为90%以上，甚至可达到100%；治疗银屑病有效率达到85%以上，甚至可达到100%。包勒朝鲁等[6]对18 味丸进行长期毒性研究发现，各组大鼠一般观察情况、血液学指标、血液生化指标均无显著性变化，且一段时间后高剂量组脏器病变情况逐渐恢复，18 味丸用药较为安全，且大鼠灌胃给药基本安全剂量为0.92 g·kg-1（相当于临床拟用剂量的25 倍）。18 味丸中含汞药物的大量使用及对疾病的确切疗效表明，汞元素可能对免疫系统具有一定的调节作用[7]。本文从汞元素的形态和汞在动物个体及细胞水平的免疫调节机制等方面进行论述，进一步说明蒙药孟根乌苏燥“协日乌素”的功效及其机制。

1 汞元素形态

民族药中的汞元素主要以硫化汞形态入药，其结构稳定、溶解度极低、口服吸收度较差，经过复杂的形态演化才能以可溶形态被人体吸收[8]。汞的不同形态在体内的吸收、分布、代谢情况不一样。汞的可吸收形态主要包括无机态、有机化合物态和生理活性物质结合态。无机态的汞主要以游离态Hg2+和Hg+形式存在，游离态Hg2+具有较高的化学活性；有机化合物态主要为短链烷基汞，如甲基汞；生物活性分子常与汞以共价、配位或超分子形式结合，称为生理活性物质结合态。汞在药物中和体内的存在形态及其协同和拮抗作用是药理和毒理研究的基础[9-10]。Shi等[11]分析了氯化汞（HgCl2）、甲基汞和朱砂安宫丸的神经毒性，结果表明，朱砂安宫丸的神经毒性明显比HgCl2和甲基汞小。Tsoi 等[12]报道，朱砂和雄黄为安宫牛黄丸中神经保护的中药成分，且对短暂性脑缺血、脑损伤大鼠不存在肝肾毒性，但普通砷和汞单独使用时不仅没有神经保护作用且具神经毒性。因此，讨论汞的形态演化过程对汞元素毒性和作用机制研究具有重要意义。

1.1 无机配体对汞的形态演化的作用

目前，硫化汞的溶解过程研究主要集中在盐酸和硫化物溶液或含有厌氧微生物的环境中，这与人体消化道环境类似，对于研究朱砂、孟根乌苏等矿物药的代谢和生物转化具有一定参考意义。Zhang等[13]发现，细菌对汞甲基化有很大影响，汞甲基化细菌特别是脱硫弧菌产生的脱硫弧菌胞外聚合物（EPSND132）将大大提高纳米微粒汞的甲基化潜力。曾克武等[14]系统研究了朱砂在人体消化道环境内的溶解和形态转化。结果显示，含巯基的氨基酸对朱砂的促溶作用有限，而硫化钠和盐酸对朱砂中汞溶出量的影响较大。据此推测，朱砂在胃肠道中的溶出物可能主要是汞的含硫配合物。此外，Zhou等[15]在模拟肠和胃条件下讨论了肠道细菌对朱砂转化形态的影响，发现朱砂在肠道内主要是以硫化汞为溶解成分，具有较好的药理作用。这些结果对于解释民族药中含汞矿物药多与硫化物配伍使用，而不能与卤化物配伍，具有一定的参考价值。

1.2 生物分子配体对汞形态的作用

生物体内，汞与含硫配体、氨基、羧基、咪唑、嘌呤和嘧啶形成配合物，这对于汞形态的体内演化和代谢研究具有重要意义。汞与含硫配体的结合性最强。汞化合物可同时靶向肽和蛋白质中的半胱氨酸（Cys）和硒代半胱氨酸（Sec）残基[16]。在Stricks等[17]报道了汞与谷胱甘肽（GSH）和Cys配位化合物后，汞与多种氨基酸、多肽、嘌呤、大环多胺等生物小分子形成稳定配合物的情况也相继报道。由于汞（Ⅱ）-硫醇化合物有很高的热力学稳定性，汞和Cys、GSH 的结合常数远大于其他配体，但其在生理体系中仍然是不稳定的，根据蛋白质的游离基团不同，汞将在酶和其他分子的硫醇基间交换结合[18]。Cheesman 等[19]研究了汞与GSH、Cys 和青霉胺的结合形式及其存在寿命。结果显示，汞首先与上述配体形成二巯基汞［Hg（SH）2］络合物，然后通过1个三巯基汞［Hg（SH）3］形式的络合物，硫醇配体在游离汞和［Hg（SH）2］之间迅速交换。2 种配位化合物的平均寿命分别为1.10、0.15 ms。其中与GSH的结合是人体内最主要的结合形式（图1）。

图1 汞的体内形态演化过程

氨基酸可以多种形式与甲基汞配位，包括终端-NH3+、-NH+、-OH、-C（=O）NH2，终端-COO-、-SH、-SCH3，侧链-NH3+、-COO-等[20]。Mokrzan等[21]研究了甲基汞以各种配位形态穿透血脑屏障，发现甲基汞与L-Cys 形成络合物后，通过氨基酸传输系统进入脑毛细内皮细胞，其血脑屏障的穿透能力较强。其他含硫配体，如L-高半胱氨酸、L-青霉胺、二巯基丁二酸、N-乙酰-L-Cys 和GSH 的结合物对血脑屏障的穿透能力分别仅有L-Cys 的82%、57%、19%、10%和8%。这为合理选择含巯基配体，从而减少甲基汞对血脑屏障的穿透提供了依据。

汞与生物大分子的结合研究由于缺乏较有力的研究手段而进展甚微，仅有汞与蛋白质、DNA 及汞与细胞结合情况的报道。例如，Vieira等[22]对鱼类肝脏组织中的蛋白质进行二维聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，发现含有汞结合蛋白，并采用石墨炉原子吸收法进行定量分析。Buncel 等[23]发现，汞可与DNA 的胸苷（Thy）和鸟苷（Guo）以混合配位的形式结合，稳定性次序为Thy-Hg-Thy ＞Guo-Hg-Guo ＞Thy-Hg-Guo，并提出汞作用于DNA 后以Thy-Hg-Thy 内链螯合的形态存在。

2 汞在动物个体水平的免疫调节机制

2.1 诱导自身免疫系统易感性

通常认为，汞摄入会诱导自身免疫性疾病的发生，甚至有研究发现，通过对正常动物使用含汞化学物质可形成具自身免疫性疾病的动物模型[24]。Hultman等[25]发现，通过汞诱导的全身性自身免疫性疾病严格依赖于T 细胞，特别是辅助性T 细胞，且在停止治疗后，汞诱导的抗核抗体水平会维持很长一段时间。为了确定炎性T 细胞和辅助性T 淋巴细胞比例（Th1/Th2）失衡是否能直接导致汞诱导自身免疫易感性，Kono 等[26]用白细胞介素-4（IL-4）和γ-干扰素（INF-γ）基因敲除小鼠研究原型Th2 介导的汞引起自身免疫系统易感性。结果表明，Th1/Th2失衡并不会直接导致汞诱导自身免疫易感性。Hu等[27]通过研究抗干扰素抗体和汞治疗对IL-4 基因敲除小鼠的作用，发现小鼠的基因类型与汞诱导的自身免疫易感性高度相关。

2.2 诱导产生自身免疫性疾病或导致病情加重

Pamphlett 等[28]研究发现，妊娠小鼠在妊娠后期每天暴露于无毒剂量的汞蒸气中，其新生儿的视网膜神经节细胞和内皮细胞的核膜中可见汞。并发现汞可诱导自由基形成，增加变性中枢神经系统疾病的发病率。Caruso 等[29]认为，汞会加剧宿主对微生物或者其他因素的触发反应。他们将有传染性的体外抗柯萨奇病毒（CVB3）心脏组织提取物接种在正常Balb/c 小鼠体中，发现小鼠会出现自身免疫性心肌炎，用低剂量汞处理后疾病的严重程度和患病率增加。同样Penta等[30]采用易感染CVB3的雌性Balb/c小鼠，在感染前每天给予200µg·kg-1HgCl2，连续处理2周，并于感染6 h后从脾脏和腹膜分离免疫细胞，进行流式细胞术、基因表达和细胞因子分析。感染35 d 后，对心脏进行免疫细胞浸润的组织学检测。结果显示，汞暴露显著增加自身免疫性心肌炎和心脏免疫性浸润。在早期6 h的感染后，汞增加了腹膜巨噬细胞的共刺激分子和天然免疫受体的表达。同时，选择性活化的巨噬细胞基因、精氨酸水平增加，而经典活化的巨噬细胞基因、诱导型一氧化氮合酶不受影响。汞暴露时，腹膜B 细胞上的活性标记物表达降低，而T 细胞不受影响。汞暴露后感染CVB3会导致巨噬细胞招募的趋化因子和活化的细胞因子，如IL-6、趋化因子2（CCL2）、CCL4 水平增加。且汞增加脾脏中促炎介质的产生。研究结果显示，汞可诱导啮齿类动物形成自身免疫性疾病模型或导致病情加重。

2.3 不同摄入剂量引起的自身免疫系统平衡变化

尽管在动物模型上汞具有免疫毒性，但汞是否也会诱导人类自身免疫疾病这一问题尚不清楚。因此，汞对自身免疫系统的影响需要进一步确认。Hultman等[31]研究了基因敏感雌性SJL/N小鼠的汞摄入剂量与诱导自身免疫疾病和免疫复合物疾病的关系。结果显示，以平均肾汞浓度（1.25×10-6）的剂量连续给药10 周，即可观察到免疫球蛋白G（IgG）的血清抗核抗体。当剂量达到5×10-6时，所有的小鼠均出现IgG的血清抗核抗体，并且IgG和免疫复合物在肾血管出现沉积，进而引起肾小球毛细血管内皮细胞的增殖和肾小球膜增生。结果发现，脏器中汞浓度和自身免疫性疾病发生与摄入剂量是正相关的。

高剂量的汞具有高毒性，而中低剂量的汞具有免疫调节的作用。汞剂量在15 ng·mL-1以上可显著降低细胞活力（P＜0.05），低剂量对Th1 和Th2 细胞因子的表达有不同的影响，取决于细胞激活途径。在单克隆抗体MoAb刺激的细胞中，IFN-γ、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和IL-6 的产生会减少。汞剂量分别达到0.150、0.500 μg·mL-1时会增加IL-10 和IL-4，从而显著降低Th1/Th2 比值。但IFN-γ和IL-10 诱导刺激热灭活肠炎沙门氏菌HK-SE，会导致Th1/Th2 的比值升高[32]。综上所述，可以认为低剂量的汞摄入，在无炎症的情况下，免疫反应向Th2 极化，但与沙门氏菌抗原引起的Th1极化反应不同。

上述研究表明，摄入剂量和个体差异对由汞刺激引起的Th1/Th2平衡改变有不同的影响，这对理解民族医药中含汞药材入药具有重要的实验和科学意义。

3 汞在细胞水平的免疫调节机制

研究汞在细胞水平上的分子机制可以更好地理解其体内作用机制，从而合理利用该药物。汞离子可以和血浆蛋白的巯基、GSH 和金属硫蛋白形成巯基化合物[33]。巯基化合物具有许多重要的生理功能，包括维持细胞内氧化还原平衡，且含有巯基的GSH和Cys 是体内免疫调节的重要物质。汞的吸收、蓄积和毒性依赖于细胞内GSH 水平。因此，研究汞与GSH和Cys相互作用将有助于了解汞免疫调节机制。

Becker等[34]研究发现，不同浓度的HgCl2会直接刺激细胞内GSH合成，细胞内GSH水平与含汞量呈负相关，暴露于低浓度HgCl2的细胞中GSH 的合成受到刺激较小。Shenker 等[35]发现，在汞离子浓度高达1250 ng·mL-1时，T细胞的GSH含量减少了近70%；用HgCl2处理的B细胞也显示出GSH水平下降情况，但当暴露于低浓度汞时，细胞内GSH 会增加。

与此相反，多数报道显示，Hg2+暴露将以时间和剂量依赖的方式耗尽细胞内GSH 的储存量[36]。细胞内GSH储存量耗尽，会导致Th1/Th2细胞比例失衡，引起免疫细胞的Th2 反应[37]。硫柳汞暴露于树突细胞，会导致T 细胞增加Th2 细胞因子IL-5 和IL-13，降低Th1 细胞因子INF-γ[38]。由于硫柳汞在体内会迅速分解为Hg2+，因此Hg2+引起的免疫系统内GSH 耗尽可能是较强Th2反应的潜在原因。

近年来，汞与含巯基化合物的体外活性和结构研究取得了一定的进展。Qiao 等[39]研究发现，GSH能参与体内硒（Se）与汞的代谢，促进低毒汞硒配合物的形成。GSH-Se-Hg 的相克作用机制包括2 个过程：GSH 与汞和Se 竞争性结合及形成（HgxSey）n（GSH）m复合物。这一过程解释了Se 与汞的拮抗作用可以降低汞在生物体内的毒性。此外，汞会对细胞造成严重损伤，可引起各种亚细胞效应。Yuan等[40]以斑马鱼细胞ZF4 作为模型，采用聚集诱导发射聚集诱导发光探针，发现Hg2+和甲基汞都降低了平均溶酶体pH，具有相反的作用和机制，且Hg2+的影响较大。Ajsuvakova等[41]发现，汞与Cys的结合产生了汞的许多毒性反应，尤其是对含有游离Cys 残基的酶和其他蛋白质的抑制作用。特别是，汞-巯基可能通过干扰蛋白激酶B/环腺苷酸反应元件结合蛋白通路（Akt/CREB）、Kelch 样环氧氯丙烷相关蛋白-1/核转录因子E2相关因子2（Keap1/Nrf2）信号通路、核转录因子-κB（NF-κB）和线粒体途径促进细胞凋亡调节。

林秀武等[42]研究表明，甲基汞对红细胞膜及脑、肝和肾微粒体膜上的总三磷酸腺苷（T-ATP）酶、Mg2+-ATP 酶、Na+-K+-ATP 酶活性有显著的抑制作用，同时，甲基汞使细胞膜及脑微粒体膜中巯基含量显著下降，导致膜的构象和功能改变。荧光偏振技术测定表明，汞使红细胞膜及脑、肝、肾微粒体膜的流动性降低。高剂量的甲基汞对DNA 修复能力和合成能力有抑制作用，而低剂量的甲基汞有显著的刺激作用。上述结果对揭示含汞矿物药在细胞水平上的药效作用有重要参考价值。

4 讨论

复方中药物成分可能首先与硫化汞形成配合物，促进了汞以低毒的形式溶出，进入体内后与巯基化合物快速地进行一系列转化，最终在细胞膜与巯基配体结合，进入细胞。汞可能通过与GSH 和Cys 作用调节免疫细胞的细胞因子水平，诱导Th1/Th2 分型变化，引起了自身免疫调节的变化。上述发现可知，汞的形态、摄入剂量及个体差异对于免疫机制研究具有重要作用，且汞的形态演化机制研究对民族药汞代谢研究具有重要的参考价值。当前，自身免疫性疾病的治疗主要依靠免疫抑制剂来纠正免疫失调和抑制变态反应性炎症，但会造成极大的不良反应，如头痛、抑郁、视觉障碍、败血症、急性肾功能衰竭等。蒙医研究表明，孟根乌苏对自身免疫性疾病的治疗有积极的效果，且不良反应小，故详细研究蒙药孟根乌苏燥“协日乌素”的治疗机制对于阐释蒙药用汞的科学内涵具有重要意义。采用蒙医药理论结合现代科学研究结论进行探索论证，使孟根乌苏可以发挥最佳治疗效果，合理利用、开发药物新剂型，对蒙医药发展具有极大推动作用。