张 媛，马 媛，鲁 杨，刘颖燕，周露秋，刘 芳

(1.乐山市人民医院妇产科，四川 乐山 614000；2.空军军医大学唐都医院妇产科，陕西 西安 710038)

子痫前期(Preeclampsia，PE)是以高血压、蛋白尿等多系统器官功能紊乱为主要表现的全身性疾病，是妊娠期导致孕产妇及胎儿不良结局的常见疾病[1]，目前发病机制尚不明确。相关研究提示PE为多种因素共同导致的疾病[2]，其中，螺旋动脉重铸不足而导致的胎盘功能障碍是该疾病的主要病因学说；胎盘源性因素作用于全身系统，引发的包括血管内皮功能障碍、炎性反应激活等一系列病理表现可能为PE发生的潜在机制。相关研究[3-4]表明，非编码RNA(non-coding RNA，ncRNA)包括长链非编码RNA(lncRNA)、微小RNA(miRNA)等在PE患者胎盘组织中差异性表达，这些ncRNA能够通过交互调控，影响下游靶基因，在调节滋养细胞功能、子宫螺旋动脉重铸等过程中发挥作用，从而参与PE发病。定位人类染色体11p15.5 位置的lncRNA-kcnq1重叠转录物1(lncRNA-kcnq1ot1)被发现在肿瘤发生发展、心肌缺血再灌注等领域内发挥重要作用[5-6]。其中，lncRNA-kcnq1ot1在PE患者胎盘组织中低表达，并能够间接影响滋养细胞的增殖、侵袭和迁移[7]。此外，lncRNA-kcnq1ot1能够直接参与脂多糖诱导的血管内皮细胞凋亡[8]，提示其具有对上皮类细胞的调节功能。在人视网膜上皮细胞模型中，lncRNA-kcnq1ot1能够负性调控miR-19a，通过发挥内源性竞争性RNA (competing endogenous RNA,ceRNA)作用[9]。而miR-19a与PE具有相关性已得到验证[10]。因此，进一步明确lncRNA-kcnq1ot1与PE的相关程度，及其能否通过对miR-19a发挥相关作用，影响人脐静脉内皮细胞(HUVEC)功能参与PE疾病发病过程，值得探究。

1 材料与方法

1.1 一般资料 收集2019年10月至2020年8月在乐山市人民医院妇产科住院行剖宫产分娩的15例PE晚孕患者(PE组)，诊断标准严格依据第9版《妇产科学》[8]，该组患者除PE外无其他妊娠期合并症，孕周(38.1±1.1)周，年龄(29.1±4.3)岁，体重指数(Body Mass Index，BMI)(26±1.9)kg/m2。同时收集同期住院分娩的正常孕妇15例作为对照组，该组患者无妊娠期合并症，孕周(38.4±1.2)周，年龄(28.4±4.6)岁，BMI(26.1±2.3)kg/m2。两组孕妇均为单胎初产妇，入院前均未接受任何治疗，既往无遗传性、传染性疾及代谢性疾病病史；无慢性病药物使用、放射线及毒物接触史，无家族性遗传病史。两组孕妇孕周、年龄、BMI比较无统计学差异(均P>0.05)。本研究经医院伦理委员同意并批准，所有患者均签署知情同意书。

1.2 主要细胞、试剂和材料 HUVEC购自ATCC中国细胞库；RPMI 1640培养基、胎牛血清(FBS)、青霉素-链霉素(美国Gibco公司)；F12K培养基、磷酸缓冲盐溶液(PBS)(武汉普诺赛科技有限公司)；Prime Script RT Reagent kit、SYBR Premix Extaq RT-PCR kit(日本Takara公司)；Lipofectamine 2000(美国Thermo Fisher公司)；pcDNA3.1-kcnq1ot1、siRNA-kcnq1ot1质粒(广州吉赛生物科技股份有限公司)；Trizol(美国Invitrogen公司)；PCR引物序列(中国擎科生物有限公司)；RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒(中国碧云天公司)；CDKN2B、Cyclin D1、β-actin单克隆抗体、HRP标记二抗(武汉博士德生物工程有限公司)；PVDF膜(美国Millipore公司)；ECL底物液(北京普利莱基因技术有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 血清及胎盘标本收集：入院后在接受药物及手术治疗前，分次采集、收集纳入的两组患者晨起空腹肘静脉血共计5 ml。所有血浆样本均在采集后置促凝管中，4 ℃静置过夜后2000 r/min离心5 min，吸取上层血清至EP管中，-80 ℃冰箱保存备用。于胎盘娩出后迅速收集两组患者胎盘组织标本，取1 cm×1 cm×1 cm大小组织若干块，PBS液中迅速漂洗后，置入液氮中保存备用。

1.3.2 细胞培养及转染：将HUVEC取出后解冻，接种于含10% FBS、1%青霉素-链霉素的RPMI 1640培养基中，37 ℃、5% CO2饱和湿度条件下培养。取对数生长期的HUVEC，用RPMI 1640培养基制成单细胞悬液，按每孔2×105个细胞量，均匀的接种于6孔板中，37 ℃、5% CO2饱和湿度条件培养过夜；待细胞生长密度至80%左右时按照Lipofectamine 2000说明书要求行转染实验。实验分组：过表达组(转染pcDNA3.1-kcnq1ot1)、抑制组(转染siRNA-kcnq1ot1)、对照组(未转染组)。转染48 h 后qRT-PCR检测三组HUVEC中miR-19a表达情况。

1.3.3 lncRNA- kcnq1ot1及miR-19a mRNA表达水平检测：转染48 h 后，Trizol法分别提取血清标本、胎盘组织中以及三组HUVEC细胞中总RNA；检测RNA质量后，按照Prime Script RT reagent kit、SYBR Premix Extaq RT-PCR kit说明书步骤进行qRT-PCR反应。引物序列见表1。反应条件：95 ℃、10 min，95 ℃、15 s，60 ℃、30 s，95 ℃、15 s，40个循环。以U6为内参，进行PCR反应。每次检测设定3个复孔，每个样本重复3次。根据PCR扩增曲线，使用 2-△△Ct法计算目的基因lncRNA- kcnq1ot1、miR-19a mRNA水平的表达情况。

表1 目的基因引物序列

1.3.4 CDKN2B、Cyclin D1蛋白表达水平检测：转染48 h后，RIPA裂解液分别提取三组HUVEC中总蛋白；检测蛋白浓度后，Western blot检测外泌体特征性蛋白：配胶后十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)；将目的条带电转至PVDF膜；一抗4 ℃孵育过夜[抗体浓度CDKN2B 1∶1500、Cyclin D1 1∶1000、β-actin(内参)1∶500]；HRP标记二抗(1∶10000)室温孵育2 h；ECL显影、定影，Band Scan分析胶片灰度值。

1.3.5 HUVEC成管能力检测：转染48 h后，取对数生长期的HUVEC，用F12K培养基制成单细胞悬液，按每孔2×105个细胞量，接种到6孔板中，37 ℃、5% CO2饱和湿度条件培养过夜；实验分组同1.3.2中细胞分组。培养48 h后，使用0.25%胰酶消化HUVEC，用无血清培养基制成单细胞悬液，按照每孔1×105/个细胞，均匀的接种到预铺有基质胶的24孔板中，37 ℃、5% CO2过夜培养；培养8～12 h后拍照观察，并进行统计学分析。

2 结 果

2.1 血清、胎盘组织中lncRNA-kcnq1ot1及HUVEC中miR-19a mRNA表达水平比较 qRT-PCR结果显示，与正常组孕妇血清及胎盘组织中lncRNA-kcnq1ot1表达水平相比，PE组孕妇血清及胎盘组织中lncRNA-kcnq1ot1的表达降低(均P<0.05)，见表2。与对照组相比，过表达组HUVEC中miR-19a在mRNA水平表达降低，而抑制组HUVEC细胞中miR-19a在mRNA水平表达增高(均P<0.05)，见表3。

表2 两组血清、胎盘组织lncRNA-kcnq1ot1mRNA表达水平比较

表3 各组HUVEC中miR-19a mRNA表达水平比较

2.2 各组HUVEC中CDKN2B、Cyclin D1蛋白表达水平比较 与对照组相比，过表达组HUVEC中CDKN2B、Cyclin D1在蛋白水平表达增高，而抑制组HUVEC细胞中CDKN2B、Cyclin D1在蛋白水平表达降低(均P<0.05)，见图1(表4)。

图1 各组HUVEC中CDKN2B、Cyclin D1蛋白表达情况

表4 各组HUVEC中CDKN2B、Cyclin D1蛋白表达水平比较

2.3 管样形成实验检测各组HUVEC功能 管样形成实验结果显示，与对照组相比，过表达组HUVEC的管腔形成能力，包括总分支长度及管腔数均增高(均P<0.05)，抑制组HUVEC的管腔形成能力，包括总分支长度及管腔数均降低(均P<0.05)，见表5(图2)。

图2 各组HUVEC管形成能力(×200)

表5 各组HUVEC中管形成能力情况

3 讨 论

PE是导致母胎死亡的重要因素之一[1,10]。在临床中发现，PE患者一旦胎盘娩出，其症状即可缓解或消失[11-12]，提示胎盘功能异常与PE发病的直接相关性。而正常的血管内皮细胞功能则在胎盘建立以及螺旋动脉重塑等过程中起到至关重要的作用，如存在血管内皮细胞功能障碍，会成为复发性流产、PE等疾病的直接诱因[13]。

lncRNA-miRNA构成的网络系统能够参与多种病理生理过程[14-15]，已经在PE病因研究领域中得到了明确[16-17]。本研究中，我们发现与正常孕妇相比，lncRNA-kcnq1ot1在PE患者血清及胎盘组织中均表达降低，提示从局部胎盘组织到母体全身循环系统，lncRNA-kcnq1ot1均存在差异性表达，lncRNA-kcnq1ot1可能与胎盘功能障碍、血管内皮损伤等PE相关的病理过程存在相关性。我们在PE胎盘中发现的lncRNA-kcnq1ot1表达趋势与陈芳荣等[7]文章中报道一致。lncRNA在转录水平以及表观遗传层面均可发挥生理作用，但是却无法直接编码功能性蛋白，其大多通过发挥ceRNA等作用方式调控miRNA从而实现其功用[18]。张妮红等[9]发现过表达lncRNA-kcnq1ot1能够下调miR-19a水平，并进一步在人视网膜上皮细胞中验证了上述两者间的负向调控关系，并发现抑制lncRNA-kcnq1ot1的条件下，高表达的miR-19a能够通过抑制细胞因子信号转导抑制因子3表达，从而影响内皮细胞增殖及凋亡[9]。本研究中发现，在HUVEC中过表达与抑制lncRNA-kcnq1ot1后，miR-19a的表达也呈现出被负性调控的趋势。这与张妮红等[9]的发现结果一致。

既往研究发现miR-19a在PE患者胎盘组织[11]血清中均高表达[19]，并可在人绒毛癌细胞中靶向调控人类白细胞抗原G( Human leukocyte antigen G，HLA-G) 参与PE发病。此外，在不同的细胞或组织平台中，miR-19a还被验证和CDKN2B[18]、Cyclin D1[19]也具有靶向结合关系，与血管平滑肌细胞增殖迁移功能、血管内皮细胞修复能力等相关。本研究中，我们发现抑制lncRNA-kcnq1ot1表达后，miR-19a表达增高，并且HUVEC的管腔形成能力降低；且HUVEC中CDKN2B、Cyclin D1在蛋白水平也呈现低表达。相关研究表明，miR-19a过表达时，由于CDKN2B的作用，能够减轻miR-19a对血管平滑肌细胞增殖、迁移的抑制[19]，这一过程与CDKN2B调节基质金属蛋白酶2、9的表达相关。Cyclin D1作为细胞周期蛋白依赖性激酶的调节性因子，主要在细胞增殖功能中发挥重要作用；而相关研究[20]已发现Cyclin D1与miR-19a间具有负性调控关系，过表达miR-19a会引起Cyclin D1表达降低，抑制HUVEC增殖能力。通过上述研究提示：PE时，低表达的lncRNA-kcnq1ot1可能通过对miR-19a发挥ceRNA样作用，进一步影响了miR-19a靶基因CDKN2B、Cyclin D1的表达，诱发HUVEC功能异常；一方面导致了螺旋动脉重铸障碍、胎盘形成异常，而另一方面，母体血液中低表达的lncRNA-kcnq1ot1也可能加重了PE时母体血管内皮损伤及全身炎性反应的进展。但是，上述过程涉及的具体机制还需在后续的研究中进一步探索。

综上，lncRNA-kcnq1ot1在PE患者胎盘组织、血清中具有一致的低表达趋势，明确了其与PE的相关性；lncRNA-kcnq1ot1可能通过负性调控miR-19a从而抑制HUVEC成管能力，参与PE发病过程。本研究，为进一步探讨ncRNA在PE发病过程中的具体作用方式、以及ncRNA能否具有成为PE疾病标志物的潜力等方面提供了一定理论依据。