李福平，王 茂，邱春丽，马海龙，李 宏，代引海

(1.陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046；2.陕西中医药大学第二附属医院，陕西 咸阳 712000；3.咸阳市中心医院肿瘤内科，陕西 咸阳 712000)

乳腺癌是全世界范围内常见的疾病。根据2020年全球癌症数据调查显示，乳腺癌发病率已超过肺癌，位居恶性肿瘤中发病率位之首。2020年全球68.5万人死于乳腺癌，新发乳腺癌230万例，乳腺癌患者的病死率占所有恶性肿瘤病死率的15%[1-3]。虽然手术、化疗、放疗和靶向治疗等综合治疗在一定程度上提高了乳腺癌患者的总体生存率，但是乳腺癌新发病例数和死亡人数仍然在不断增加。因此，我们迫切需要新的治疗手段及策略去预防和控制乳腺癌。近年来，利用天然产品预防癌症已经得到了相当多的关注[4]。在各种天然产物中，莱菔硫烷(Sulforaphane，SFN)是从西兰花中提取的一种硫氰酸盐化学物质，具有抑制肿瘤生长的特性。相关研究已证明SFN可以抑制细胞周期进程，诱导凋亡细胞死亡，并抑制多种癌症细胞的血管生成[5-6]。维生素D(Vitamin D,VD)一种类固醇激素，是人体不可或缺的维生素之一。近年来，国内外许多研究表明，VD在肿瘤细胞的生长和代谢中起着重要作用[7-10]。有趣的是，SFN和VD都对乳腺癌的生长均有抑制作用，并且在乳腺癌的机制和信号通路上相似。然而，这两种物质联合对乳腺癌细胞的作用效果如何，目前鲜有报道。因此，本研究通过初步探讨SFN联合VD对人乳腺癌MCF-7细胞增殖的干预作用，为预防和控制乳腺癌提供新的策略。

1 材料与方法

1.1 细胞与仪器 人乳腺癌MCF-7细胞(湖南丰晖，CL0206)。仪器主要包括CO2培养箱(美国ThermoFisher，3131)、离心机(美国Eppendorf，5417R)和流式细胞仪(美国BD，FACSV)。

1.2 药物与试剂 药物包括SFN(美国 MCE，HY-13755)和VD(美国 MCE，HY-15398)。试剂包括DMEM 培养基(武汉普诺赛，PM150210)、10%胎牛血清(Fatal bovine serun，FBS)(美国 Gibco，12664025)、青霉素-链霉素溶液(双抗，武汉普诺，PB180120)、0.25%胰酶(美国Hyclone，SH30042.01)、二甲基亚砜(DMSO)(美国 Thermo Fisher，D12345)、细胞增殖/毒性检测(CCK-8)试剂盒(美国 Glpbio，GK10001)和Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒(上海翌圣生物,40302ES20)。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养：按常规方法将人乳腺癌MCF-7细胞复苏，在含10%胎牛血清和青霉素-链霉素混合溶液(按100倍稀释)的DMEM培养基中培养，置于37 ℃、5% CO2恒温培养箱培养。待乳腺癌细胞汇合度达到70%～90%时，加1 ml的0.25%胰酶进行消化后离心，吹打成细胞悬液，最后按照1×104个细胞/孔将细胞悬液接种于48孔细胞培养板中，加入适量新鲜培养基，于细胞培养箱中培养过夜。

1.3.2 实验分组：实验分为SFN组、VD组、SFN+VD组各加入对应的SFN或VD，两种药物浓度都分别设为2、5、10 μmol/L，并且将只加入0.1% DMSO溶剂组设为空白对照组。

1.3.3 显微镜下观察细胞形态：对照组、SFN组、VD组、SFN+VD组加入对应的SFN或VD，于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养48 h，并在倒置显微镜下观察人乳腺癌MCF-7细胞形态变化。

1.3.4 细胞血球板计数：药物处理后乳腺癌MCF-7细胞继续培养48 h，加入0.1 ml的0.25%胰酶吹打成细胞悬液。每孔取少量细胞悬液，将细胞悬液滴入盖有盖玻片的血细胞计数板中间平台两侧的沟槽中，使细胞悬液充满盖玻片与计数板间(不要有气泡)，静置2～3 min，通过显微镜计算四个大方格(由4×4的小方格组成)中的细胞，计算细胞总量。公式为：细胞数/ml=四大格细胞总数/4×104，每组实验重复5次。

1.3.5 CCK-8法检测细胞增殖：药物处理后乳腺癌细胞继续培养48 h，实验组和对照组分别各设置5个复孔,最后分别向每孔加入20 μl的CCK-8溶液，继续放置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养3 h，选择450 nm波长，然后在酶标仪上测定各孔吸光度(OD)值，以确定不同浓度SFN或VD对人乳腺癌MCF-7细胞活力的影响。抑制率=[(对照组OD值-实验组OD值)/对照组OD值]×100%。

1.3.6 流式细胞术检测细胞凋亡：将培养的乳腺癌细胞加入0.25%胰酶(不含EDTA)，离心、洗涤后加500 μl的结合缓冲液(Binding buffer)重悬细胞。避光添加5 μl膜结合蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC) 混匀，室温避光孵育15 min 后，加入5 μl的碘化丙啶(PI)染色液，避光孵育10 min 后过膜上机。先根据SSC/FSC图选择细胞群，之后对选择的细胞群进行作图。分别将二维散点图的X和Y轴设为Annexin V和PI，同时将散点图分为4个象限(根据未染色的细胞确定)，Annexin V-/PI+区域(左上)的细胞为坏死细胞；Annexin V+/PI+区域(右上)的细胞为晚期凋亡细胞；Annexin V+/PI-区域(右下)的细胞为早期凋亡细胞；AnnexinV-/PI-区域(左下)的细胞为活细胞。细胞凋亡率为Annexin V+/PI+区域细胞比例加Annexin V+/PI-区域的细胞比例。

2 结 果

2.1 SFN和VD对乳腺癌细胞形态的影响 见图1。在倒置显微镜下可以观察到，正常培养的人乳腺癌MCF-7细胞多呈不规则多边形，紧密排列、单核、单层贴壁生长。 加入VD或SFN后，上述MCF-7细胞数量随药物浓度增加而逐渐减少，细胞形态也逐渐皱缩。在高浓度下(10 μmol/L)，各组MCF-7细胞的生长受限较为明显。

图1 不同药物干预下MCF-7细胞倒置显微镜下形态观察(吉姆萨染色,×100)

2.2 SFN和VD对乳腺癌细胞数量的影响 见图2。细胞血球板计数结果表明，随着SFN或VD浓度的上升，MCF-7细胞的数目随之下降。当SFN和VD浓度在10 μmol/L时，相对应的SFN组和VD组中的MCF-7细胞数目分别减少到对照组的49.47%和52.55%，单因素方差分析显示，差异具有统计学意义(均P<0.01)。此外，在SFN+VD组中，乳腺癌MCF-7细胞数目均明显减少，特别在两种药物混合浓度为10 μmol/L时，MCF-7乳腺癌细胞数目减少到对照组的28.72%，单因素方差分析显示，差异具有统计学意义(P<0.01)。

注：与对照组比较，*P<0.01，△P<0.001

2.3 SFN和VD对乳腺癌细胞增殖的影响 见图3。CCK-8法检测细胞增殖结果表明，MCF-7细胞在低浓度(2 μmol/L)的SFN和VD单独作用时，其细胞增殖的抑制不明显，但是MCF-7细胞在高浓度(10 μmol/L)的SFN和VD单独作用时，吸光度值下降幅度大，细胞增殖受到明显抑制。另外，当SFN联合VD组的浓度仅为5 μmol/L时，就已经对MCF-7细胞产生明显的抑制作用，此时MCF-7细胞增殖活力为对照组的47%。当药物浓度为10 μmol/L时，SFN组、VD组和SFN+VD处理组中的MCF-7细胞增殖活力分别为对照组的47.54%、43.38%和32.29%,单因素方差分析显示，差异具有统计学意义(均P<0.01)。

注：与对照组比较，△P<0.01

2.4 SFN和VD对乳腺癌细胞凋亡的影响 见图4。流式细胞术检测细胞凋亡结果显示，与对照组相比，MCF-7细胞在VD、SFN以及VD+SFN联合干预48 h后，MCF-7细胞的凋亡比例(散点图中的右上区域+右下区域的离散点总数目)随药物浓度的增加而显著上升。其中对照组、2 μmol/L(VD、SFN和VD+SFN)实验组、5 μmol/L(VD、SFN和VD+SFN)实验组和10 μmol/L(VD、SFN和VD+SFN)实验组的细胞凋亡率分别为9.99%、(18.44%、21.88%和28.20%)、(22.52%、23.95%和43.62%)和(57.90%、33.51%和90.83%)，单因素方差分析显示，差异具有统计学意义(均P<0.01)。综上所述，VD+SFN组的MCF-7细胞的凋亡率比单独药物刺激的凋亡率更高。

3 讨 论

乳腺癌是一种影响全人类健康的疾病。它是全世界女性中最常见的癌症，也是癌症相关死亡的主要原因，分别占所有癌症病例和癌症死亡病例的25%和15%[1，11]。因此，寻求多种预防和治疗乳腺癌的策略这一行动已经刻不容缓。近年来，膳食植物化学制剂因其不良反应小、成本低、毒性低等优点，已成为预防和治疗包括乳腺癌在内的癌症的有利药物[12-13]。

莱菔硫烷是一种硫氰酸盐化学物质，在西兰花等十字花科蔬菜中含量丰富。大量研究[6,14-17]表明，莱菔硫烷可以抑制多种癌症细胞的转移、增殖和侵袭。据报道，SFN可引起MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌细胞的生长阻滞和凋亡，这些与p53、p21、PTEN、DNMT1和RARbeta2的表达增加有关[17]。 Kaczyńska 等[18]研究表明，SFN联合拉帕替尼可降低HER2阳性乳腺癌SKBR-3和BT-474细胞中人表皮生长因子受体2 (HER2)、AKT和S6的磷酸化，最终抑制细胞增殖、迁移并诱导细胞凋亡。此外，多项体内研究[19-21]表明，乳腺癌小鼠给予SFN治疗后，其肿瘤体积明显缩小。本研究采用2、5、10 μmol/L等不同浓度的SFN去干预人乳腺癌MCF-7细胞，结果表明这三种浓度的SFN均可抑制乳腺癌MCF-7细胞活力，这与上述文献报道一致，并且随药物浓度的增加这种抑制效果更加显著。有趣的是，本研究还发现当SFN联合VD干预乳腺癌MCF-7细胞时，其抑制乳腺癌细胞增殖活力的能力明显强于单独使用SFN。

VD是一种类固醇类激素，在高等生物体内主要行使控制骨矿化和维持钙磷平衡的功能。大量证据表明，VD及其信号通路在乳腺癌、前列腺癌、皮肤癌和结肠癌中可能具有抗癌作用[22]。此外，研究表明补充VD可以降低女性患乳腺癌和子宫内膜癌的风险，因为它可以下调雌激素受体的表达[23]。前期相关体外研究也表明，维生素D可以抑制MCF-7乳腺癌细胞和SUM159乳腺癌干细胞的增殖活力[10]。郑舒等[24]研究发现，VD联合逍遥散还可改善产后抑郁大鼠的各项行为指标。本研究采用2、5、10 μmol/L等不同浓度的VD去干预人乳腺癌MCF-7细胞，结果表明这三种浓度的VD均可抑制上述MCF-7细胞活力，这与上述文献报道一致，并且随药物浓度的增加这种抑制效果更加显著。此外，本研究还发现当VD联合SFN去干预乳腺癌MCF-7细胞时，其抑制乳腺癌细胞增殖活力和促进细胞凋亡的能力明显强于单独使用VD。

值得注意的是，莱菔硫烷是否会对人体产生有益影响尚不清楚，因为到目前为止还没有相关的临床报道，当前研究只是在动物模型或者体外实验检测了其疗效。基于以上信息，为了更好地了解莱菔硫烷在预防和治疗乳腺癌中的功效。未来的研究重心应放在:①更好地说明其作用所涉及的分子机制；②在临床试验中证明其有效性；③确定其安全性；④莱菔硫烷联合维生素D两者所产生的协同效应是由相加作用还是增强作用引起的，还需要进一步研究去证实。

综上所述，SFN和VD都可抑制人乳腺癌MCF-7细胞增殖活力，当SFN联合VD与两类物质单独作用相比，其对MCF-7细胞增殖的抑制效果更加显著。本研究的实验结果可望为预防和控制乳腺癌提供新的策略。