张申平,周 静,徐红斌,叶 青

(上海市质量监督检验技术研究院 国家市场监管重点实验室(乳及乳制品检测与监控技术),上海 200233)

凝胶镇痛贴属于冷敷止痛类产品,由背衬层、凝胶层、防黏层等部分组成。凝胶层包含水、醇类化合物等易挥发成分(如薄荷脑、樟脑、冰片、水杨酸甲酯)[1-2]以及止痛药成分(利多卡因)[3]。其中,止痛药能够透过皮肤毛孔直达患处,起到止痛作用;水等易挥发成分的大量挥发会带走热量,在止痛的同时还能起到冷敷消肿的作用。薄荷脑从薄荷的叶和茎中提取而来,一般有D型和L型两种异构体,凝胶镇痛贴中主要使用消旋的薄荷脑,即DL-薄荷脑。该成分的含量对凝胶镇痛贴的效果有较大影响,因此提供合适的检测方法对凝胶镇痛贴产品的质量控制极为重要。

薄荷脑相关检测标准有QB/T 1793-2014《天然薄荷脑》,QB/T 1792-2011《合成薄荷脑》和《中华人民共和国药典》2020年版(ChP 2020),但其适用的检测对象均为薄荷脑粉末,不包括含薄荷脑成分的成品。文献方法在粉末[4-5]及液体[6-7]基质样品中应用较多,且存在较大基质效应,需要通过样品稀释、盐析等方法消除[8]。溶剂萃取法是贴敷类薄荷脑产品的主要前处理方法[1,9],相关文献通过采用极性溶剂提取,附火焰离子化检测器的气相色谱法(FID-GC)检测,但有机溶剂消耗量过多,成本较高,同时也未对测定值与产品标签值的差异进行分析。鉴于此,本工作优化了提取溶剂、提取时间等参数,以N,N-二甲基甲酰胺(DMF)提取样品,以FID-GC测定凝胶镇痛贴中薄荷脑的含量,并与ChP 2020中检测薄荷脑粉末的方法进行比对,以期为凝胶镇痛贴中薄荷脑含量的监控提供技术参考。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

SHIMADZU GC-2010Plus型气相色谱仪,配FID;DHG-9053A 型电热恒温鼓风干燥箱;Reax Control型涡旋振荡器;MS204S型电子天平(感量0.1 mg);Milli-Q 型超纯水机。

标准储备溶液:5 000 mg·L-1,称取0.05 g(精确到0.1 mg)薄荷脑标准品,用乙酸乙酯溶解并定容至10 mL。

标准溶液系列:取标准储备溶液0.02,0.1,0.2,0.4,1 mL于10 mL 容量瓶中,用乙酸乙酯稀释至刻度,得到10,50,100,200,500 mg·L-1标准溶液系列。

薄荷脑标准品的纯度为99.8%,规格为100 mg;乙醇、甲醇、乙酸乙酯均为色谱纯;DMF 为分析纯;试验用水为超纯水。

1.2 仪器工作条件

VF-17ms毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm,0.15μm);进样口温度250 ℃。柱升温程序:0～15 min,由50 ℃升温至300 ℃,保持3 min。检测器温度300 ℃;载气为高纯氮气,流量30 mL·min-1;柱流量1.50 mL·min-1,氢气流量30 mL·min-1,空气流量300 mL·min-1,尾吹气流量20 mL·min-1;进样体积1μL;不分流进样。

1.3 试验方法

称取约0.1 g(精确到0.1 mg)样品,撕掉防黏层后置于顶空瓶中,加入5 mL DMF,迅速盖好盖子,振荡10 s,于80℃烘箱中加热1 h。冷却至室温,分取2 mL,以5 000 r·min-1转速离心1 min。取上清液100μL 置于进样瓶中,用乙酸乙酯定容至1 mL,按照仪器工作条件测定。

称取约0.1 g样品(记为m1,精确到0.1 mg),撕掉防黏层并置于锥形瓶中,加入50 mL 水,于95 ℃振荡加热至凝胶层与背衬层分离。将背衬层取出,用乙醇清洗其表面至无凝胶残留,置于105 ℃烘箱中加热30 min,移至干燥器中放置30 min,称取质量(记为m2,精确到0.1 mg)。凝胶层质量m即为m1-m2,并由此计算凝胶层中薄荷脑的质量分数,所得结果保留至小数点后两位。

2 结果与讨论

2.1 顶空-GC的测定效果

以3个含薄荷脑5%～6%(标签值,质量分数,下同)的凝胶镇痛贴样品为待测对象,考察了顶空-GC的测定效果。参考文献[10],设定顶空-GC 的提取溶剂为乙酸乙酯,顶空温度为120～150 ℃,顶空时间为30～60 min。结果显示,在不同组合条件下,顶空-GC 测得3个样品中薄荷脑的质量分数为2.68%～3.38%,远小于标签值,说明顶空-GC 不适用于凝胶镇痛贴中薄荷脑含量的测定。溶剂萃取-GC可根据凝胶特性选择提取溶剂,针对性强。因此,试验拟采用该方法测定凝胶镇痛贴中薄荷脑含量。

2.2 提取溶剂的选择

薄荷脑可溶于乙酸乙酯、甲醇、乙醇、DMF等有机溶剂,因此试验考察了这4种提取溶剂对含薄荷脑5%～6%的凝胶镇痛贴样品中薄荷脑提取效果的影响。结果显示,4种溶剂提取薄荷脑时的测定值依次为4.77%,4.84%,1.75%,5.34%,其中用极性较大的DMF提取时薄荷脑的测定值与标签值基本一致。因此,试验选择的提取溶剂为DMF。

2.3 提取时间的选择

在较高的提取温度下,合适的提取时间有利于薄荷脑从凝胶基质中释放完全。因此,试验考察了80 ℃下提取时间分别为0.5,1,2,3,4,5 h时对含薄荷脑5%～6%的凝胶镇痛贴样品中薄荷脑提取效果的影响。结果显示,6种提取时间下薄荷脑的测定值分别为4.69%,5.26%,5.24%,5.31%,5.25%,5.32%,提取时间不小于1 h时,测定值变化不大,且和标签值基本一致。从检测效率等方面考虑,试验选择的提取时间为1 h。

在最优试验条件下,DMF、50 mg·L-1薄荷脑标准溶液以及样品溶液的色谱图见图1。

图1 DMF、薄荷脑标准溶液以及样品溶液的色谱图Fig.1 Chromatograms of DMF,menthol standard solution and sample solution

由图1可知,薄荷脑的保留时间在5.40 min附近,而16.44 min处的峰为溶剂中杂质的峰,不影响薄荷脑的测定。

2.4 标准曲线、检出限和测定下限

按照仪器工作条件测定标准溶液系列,以薄荷脑的质量浓度为横坐标,其对应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。结果显示,薄荷脑标准曲线的线性范围为10～500 mg·L-1,线性回归方程为y＝1.928×104x+4.307×104,相关系数为0.999 8。

分别以3 倍、10 倍信噪比(S/N)计算检出限(3S/N)和测定下限(10S/N),结果分别为0.02,0.07 mg·kg-1。

2.5 精密度试验

按照试验方法制备样品溶液并连续进样6次,计算测定值的相对标准偏差(RSD),结果为0.61%,说明仪器精密度良好。

按照试验方法分析6份同批次样品,所得测定值的RSD 为1.4%,说明方法精密度良好。

2.6 稳定性试验

按照试验方法制备样品溶液并分别放置0,6,12,24,36,48 h 后进样,所得测定值的RSD 为1.3%,说明样品溶液在48 h内稳定性良好。

2.7 回收试验

按照试验方法对实际样品(本底值为94.51 mg·L-1)进行加标回收试验,加标量分别为72,90,108 mg·L-1,每个加标浓度水平重复测定3次,计算回收率。结果显示,3个加标浓度水平下的测定值分别为164.43,184.24,205.37 mg·L-1,所得回收率为97.1%,99.7%,103%,说明该方法准确度高,适用于凝胶镇痛贴中薄荷脑含量的测定。

2.8 方法比对

分别采用本方法和ChP 2020中薄荷脑粉末的检测方法分析10份含薄荷脑5%～6%的凝胶镇痛贴样品。结果显示,本方法的测定值为5.23%～5.31%,ChP 2020的测定值为4.81%～5.14%。

在95%置信度下采用t检验法验证两种方法的显著性差异,所得t值(16.357)大于临界值t9,0.05(2.262),说明两种方法存在显著性差异。本方法测定值高于ChP 2020的,且在标签值范围内,说明了开发本方法的必要性。

2.9 样品分析

按照试验方法分析6个凝胶镇痛贴样品,其中前3个和后3个样品中薄荷脑的标签值(质量分数)分别为5%～6%和6.5%～7.5%,每个样品重复测定6次。结果显示,6个样品中薄荷脑的测定值分别为5.29%,5.36%,5.31%,4.47%,5.28%,7.14%,除第4个和第5个样品的测定值显著低于标签值(6.5%～7.5%),其他样品的测定值均和标签值吻合,说明溶剂萃取-GC 可作为该类产品的质控方法。

本工作以溶剂萃取法提取凝胶镇痛贴中的薄荷脑,以GC测定其含量,该方法精密度、准确度好,可用于实际样品的检测,能为镇痛贴产品的质量控制和安全监管提供技术支撑和保障。