◎ 张艳艳

（汉臣氏（沈阳）儿童制品有限公司，辽宁 沈阳 110000）

乳酸菌是基于发酵碳水化合物生成众多乳酸细菌的集合体，其在益生菌家族当中，属于十分关键的菌株之一，其在参与改善肠道菌群平衡状态、参与免疫应答以及抑制肠道病原菌生长繁殖等一系列益生功能方面，有着不容忽视的作用[1-2]。从人体内乳酸菌数量和种类最为丰富的部位——消化道来看，乳酸菌种类与数量也由于消化道部位的区别，而有着比较明显的差异。其中，胃中的乳酸菌数量相对最少，这是因为胃酸可以将一些乳酸菌杀死。但在盲肠和结肠当中乳酸菌数量相对较多，介于106～1010CFU·g-1[3-5]。

在本试验当中，运用平板培养的方式，分离出传统发酵食品当中所包含的乳酸菌，筛选出不同类型的乳杆菌各1株，将其制作成为混合菌，完成液灌胃小鼠工作[6]。借助于实时荧光定量PCR技术，进一步检测灌胃混合菌液之前、之后小鼠粪便当中6种不同乳杆菌数量所发生的具体变化，由此探索菌株具有的定植特性，掌握乳杆菌在小鼠肠道当中的定植能力状况。

1 材料与方法

1.1 试验材料

东北酸菜、酸奶，均来自市面销售；陈醋醋醅，源自陈醋醋酸发酵时期；发酵面团，源自农家自制的老面团。

1.2 培养基与试剂

MRS培养基：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母粉5 g，葡萄糖20 g，K2HPO42 g，柠檬酸二铵2 g，乙酸钠5 g，吐温-80 1 mL，MgSO4·7H2O 0.58 g，MnSO4·4H2O 0.25 g，蒸馏水1 000 mL，pH 6.2～6.4；Fast DNA Spin Kit for Soil试剂盒，由北京联立信生物科技有限公司所生产；Taq DNA酶、dNTPs、10×PCR buffer，由天根生化科技有限公司所生产；SYBR Green Supermix，BIORAD；琼脂糖回收试剂盒，由天根生化科技有限公司所生产；其他相关的化学试剂，由国药集团化学试剂有限公司所生产。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌分离和鉴定工作

将不同类型的发酵食品样品相继在生理盐水当中进行振荡处理，对上述样品溶液进行10倍梯度稀释，选择相符的稀释度，开展MRS平板涂布工作，在37 ℃恒温培养箱当中，培养时间持续48 h。在看到长出单菌落的情况下，挑选出不同形态与大小的菌落进行划线纯化处理。在完成3次分离纯化工作之后，针对菌株进行革兰氏染色镜检，并且最终确定菌株所处的形态。将完成镜检之后的菌株接种在MRS液体培养基当中进行传代培养，并将其保存在MRS斜面培养基当中，在4 ℃冰箱环境中进行保藏与备用。

1.3.2 动物实验方案

将用于实验研究的16只小鼠随机分成两组，一组作为实验组，而另外一组则作为对照组。两组小鼠在经过1周时间的适应期之后，进入干预期。在干预期内，实验组每天灌胃总量应达到6×108CFU的混合菌粉，灌胃时间为2周。对照组小鼠灌胃相同总量的脱脂乳。收集两组不同的小鼠在灌胃之前，以及灌胃之后4 d、6 d、8 d、10 d、12 d和14 d的粪便样品，在-80 ℃环境下进行保存和备用。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌的分离鉴定结果及试验菌株

从不同发酵食品当中，经过分离可以得到不同类型的乳酸菌，针对分离得到的菌株予以16S rDNA序列分析以及BLAST比对工作，进而明确菌株的相应种属，结果见表1。从表1可以了解到，从市面销售的酸奶当中分离得到鼠李糖乳杆菌与保加利亚乳杆菌，从陈醋醋醅当中分离得到干酪乳杆菌和瑞士乳杆菌，从东北酸菜中分离得到植物乳杆菌，从老面团当中分离得到酵乳杆菌。从分离得到的6种不同菌株当中，筛选出6株乳杆菌（植物乳杆菌H7、干酪乳杆菌C6、鼠李糖乳杆菌Y4、发酵乳杆菌Z1、瑞士乳杆菌C36和保加利亚乳杆菌Y3）开展后续的动物实验，进而测定其在小鼠肠道当中所具有的定植能力。

表1 不同类型发酵食品中分离的具体结果表

2.2 乳杆菌在小鼠肠道的定植能力

采集实验组小鼠在灌胃混合菌液之前与之后的粪便样品。借助于Fast DNA Spin Kit for Soil试剂盒，提取粪便样品的相应基因组DNA。将以上基因组DNA作为模板，运用6对乳杆菌特异性引物，开展荧光定量PCR扩增工作，进而获得Ct值。将不同乳杆菌标准曲线换算成为拷贝数，由此得到每克粪便样品当中所包含的6种乳杆菌量。对比接受乳杆菌处理之前与之后的小鼠粪便当中以上乳杆菌实际含量，在后者超出前者的情况下，则代表喂食的乳杆菌在小鼠肠道内部定植，可持续观察并对比每株菌具体的定植量。依次测定处在适应期最后1 d时间，以及完成灌胃4 d、6 d、8 d、10 d、12 d和14 d时间的小鼠粪便样品当中所包含的6种乳杆菌量，结果见表2。

表2 不同小鼠粪便样品中6种不同乳杆菌的含量表

由表2当中能够了解到，在灌胃完成后的两周时间内，小鼠粪便当中植物乳杆菌及干酪乳杆菌的量明显超出了灌胃之前的含量，可见植物乳杆菌H7与干酪乳杆菌C6均已超出肠道中该种菌原始状态一个数量级的水平，进而实现至少定植14 d。而对于瑞士乳杆菌C36、鼠李糖乳杆菌Y4以及发酵乳杆菌Z1来讲，则并未在小鼠肠道内部定植。保加利亚乳杆菌Y3通过相对较少的定植量，实现了定植8 d。

借助于特异性PCR引物开展荧光定量PCR，能够有效定量粪便样品当中包含的不同乳杆菌。经过一系列的检验，此类引物有着良好的特异性，可以抵抗同属不同种乳杆菌带来的干扰。6种乳杆菌标准曲线有着较高的相关性，可见PCR所处的条件十分适宜，引物特异性相对良好，这一方法可以应用在粪便样品乳杆菌的有关定量检测工作方面。将小鼠作为实验动物模型，检测6株乳杆菌在肠道当中具有的定植能力。从结果得知，不同菌株具有的定植能力差异比较明显，而定植能力大小在不同种间是否也具有差异，仍需要予以深入研究。

3 结论

现阶段，针对乳酸菌在肠道定植的研究已经有了相关成果，但定植机制并未进行深入研究。虽然当前已有体外黏附模型便于开展乳酸菌在肠道定植机制研究工作，但其体外模型无法体现出乳酸菌在肠道环境内部最为精确的定植效果。因此，建立出科学有效的定植能力的评估方法不容忽视。与此同时，复杂肠道环境中不同因素的干扰为乳酸菌在示踪和定量方面带来不容忽视的挑战。今后研究的重点，应针对此类环境干扰因素，开发出不同的示踪技术、定量方法以及借助于和其他组学结合予以相关的研究，力求追踪乳酸菌在复杂肠道环境下的具体定植位点，外加准确判断出定植时间与数量。此外还应和其他学科密切结合，如运用新型纳米材料、软件分析等有关的技术，对乳酸菌肠道定植机理开展更加精确与深层次的研究工作。未来还应探索影响菌株定植能力的一系列因素，以期借助于体外筛选的方式，获得有着良好定植能力的众多潜力益生菌。