◎ 韦华珊，刘凌雯，孔 晶，费玉清，徐 林，陈正件,3,4

（1.珠海中科先进技术研究院生物材料研发中心，广东 珠海 519000；2.广东医科大学基础医学院，广东 东莞 523808；3.中科萱嘉医养（珠海）健康科技有限公司，广东 珠海 519000；4.珠海萱嘉君行健康产业发展有限公司，广东 珠海 519000）

羊栖菜（Sargassum fusiforme）是一种藻类植物，又名鹿尾菜、玉海草、六角菜、海大麦药茶等，隶属褐藻门墨角藻目马尾藻科，素有“长寿菜”美誉[1-2]。羊栖菜的整体为黄褐色，包含茎、假根、气囊和叶片4部分，一般株高30～50 cm，是一种重要的经济藻类[3]。海洋藻类是海洋中含量和功效最丰富的自然资源，富含多糖、蛋白质、多肽、脂类、氨基酸、膳食纤维和矿物质等活性代谢产物，可用于制作食品添加剂或菜肴，如可用于烹饪蔬菜汤、制备调味品和制作轻食沙拉等，其活性代谢产物已经被广泛应用在生物医药、化妆品和食品等健康领域[4]。

根据相关研究文献，羊栖菜多糖的提取方法有水提醇沉法[5]、酶提取法[6]、酸提法[7]及超声波辅助提取[8]等方法，不同提取纯化方法和多糖的结构功能密切相关，梁美娜[1]等对羊栖菜多糖的提取工艺进行了系统总结，得知水溶液提取法的羊栖菜多糖得率在4%～10%，酶解提取法羊栖菜多糖得率在8%～19%，超声波和微波辅助提取羊栖菜多糖的多糖得率在6%～20%。在这些研究中发现，水溶液提取法能很大限度保留多糖的大分子结构，但其对目标多糖无选择性，杂质较多，加大了后续分离纯化的难度。酶解提取法虽然有较好的提取率，但生物酶成本高，不适合大量生产。酸提取法具有较好的提取率，但酸提取法只适合某些多糖的提取，适用范围窄，除此之外还有调节pH难度较大、过酸易破坏多糖结构等问题。这些方法基本都以水为溶剂，可是水的极性极大，选择性低，在提取过程中容易把蛋白质、无机盐等水溶性的成分一同提取出来，会增加后续多糖的分离纯化难度。此外，在酸性或者碱性条件下多糖的糖苷键较为容易断裂，导致多糖降解，从而影响多糖的提取效果。研究表明，离子液体（Ionic Liquids，ILs）用于多糖的溶解提取可以简化提取工艺的流程、缩短提取的时间、提高多糖的提取效率，但是，常规的离子液体在应用中尚存在毒性和生物兼容性不明的问题[9]。因此，研究者提出一种新的试剂叫天然低共熔溶剂（Natural Deep Eutectic Solvent，NADES），NADES是由一定摩尔比的氢键供体和氢键受体通过氢键结合而成的一种物质，因其与离子液体性能相似，故又叫离子液体类似物。NADES性能媲美ILs，与ILs和传统有机溶剂相比，其制备更加简单，且具有可生物降解、可回收、成本低的经济和环保优势[10-11]。此外，NADES对非极性和极性化合物都具有很强的增溶能力，并对生物活性成分具有较高的提取效率，同时NADES可以溶解大分子物质，因此，将NADES作为提取试剂提取有价值的生物活性成分，在食品、化妆品和制药行业中具有巨大的发展前景[12]。

本实验以天然来源的生物碱和有机酸构建了9种NADE提取羊栖菜多糖，为尽可能地保留多糖的活性，提取温度设定为26 ℃。通过单因素实验优化羊栖菜多糖的提取工艺，筛选出提取效果最好的NADES、超声时间、料液比和NADES含水量。将最佳实验条件下提取的羊栖菜多糖进行抗氧化功效检测，为羊栖菜多糖的进一步开发和利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

左旋肉碱、苹果酸，上海源叶生物技术有限公司；顺丁烯二酸、无水草酸、丙二酸、无水柠檬酸、脯氨酸、丁二酸、酒石酸、葡萄糖和苯酚，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；浓硫酸、无水乙醇，广州化学试剂厂。本实验所采用的试剂为分析纯试剂或纯度在98%以上，除在实验中标明之外，均未做任何纯化处理。

羊栖菜（浙江食尚农场）、50 mL离心管、50 mL量筒、100 mL容量瓶、100 mL塑料瓶、10 mL圆底离心管、125 mL抽滤瓶、布氏漏斗（内径80 mm）、玻璃表面皿、40目筛子、96孔板。

本实验中用到的仪器设备如表1所示。

表1 实验仪器表

1.2 实验方法

1.2.1 天然低共熔溶剂的制备

本实验采用无溶剂酸碱中和法和水相合成方法，避免有机溶剂等有毒物质的使用。采用天然的生物碱和有机酸进行合成制备，将左旋肉碱作为氢键受体与9种氢键供体（NADES-1：顺丁烯二酸；NADES-2：草酸；NADES-3：丙二酸；NADES-4：丙酸；NADES-5：柠檬酸；NADES-6：脯氨酸；NADES-7：苹果酸；NADES-8：丁二酸；NADES-9：酒石酸）分别按照摩尔比1∶1混合，加入特定质量的去离子水，室温下搅拌和超声（40 kHz，30 W）1～5 min，直至形成9种均一、稳定、透明的NADES溶液。

1.2.2 多糖提取

本实验使用NADES作为提取试剂，通过搅拌和超声的辅助手段加速提取过程，缩短时间，提高效率；提取完后使用反溶剂法分离回收NADES和多糖的混合物，即多糖的提取物，待检测多糖含量。

1.2.3 羊栖菜预处理

将羊栖菜用高速万能粉碎机粉碎，再过40目筛得到羊栖菜粉末。用80%乙醇对羊栖菜粉末进行醇沉，除去原料中的脂质、小分子酯和蛋白质，使粗多糖以沉淀的形式分离出来。按料液比1∶10用80%乙醇处理羊栖菜粉末，磁转2 h，然后3 000g离心20 min，取沉淀平铺于玻璃表面皿，放进干燥箱中干燥成粉末，即得到预处理后的羊栖菜原料样品，可用于后续提取实验。

1.2.4 羊栖菜多糖提取

称取1.000 g羊栖菜预处理样品加入50 mL离心管中，料液比为1∶20，NADES的含水量为40%，超声30 min。超声波辅助提取完成后进行离心，调整转速为3 000 r·min-1，在此转速下离心10 min，随后收集上清液于100 mL容量瓶内，继续向沉淀中加入20 mL去离子水充分洗涤，在3 000 r·min-1的转速下离心10 min，收集上清液，重复洗涤3次，合并上述4次上清液并用去离子水定容至100 mL，即可得到多糖提取物，先放置4 ℃冰箱暂时保存，待测多糖含量。

1.2.5 单因素实验

以去离子水为对照组，多糖含量为指标，在9种NADES提取试剂和去离子水中选取具有最优提取效果的NADES，并通过单因素实验对羊栖菜多糖提取工艺进行优化。主要从超声时间、料液比和NADES的含水量3个方面进行提取工艺的优化。

超声时间：固定料液比为1∶20，NADES含水量为40%，探究超声时间（10 min、20 min、30 min、40 min、50 min和60 min）对提取效果的影响。

料液比：固定NADES含水量为40%，超声时间为最佳，探究不同料液比（1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50和1∶60）对提取效果的影响。

NADES含水量：固定最佳的超声时间和料液比，探究不同NADES的含水量（10%、20%、30%、40%、50%和60%）对提取效果的影响。

1.2.6 多糖含量的测定

本次实验检测多糖含量采用的是苯酚-硫酸法[13]。

配制6%苯酚溶液：称取6.000 g苯酚，加入去离子水溶解，最后转移至100 mL容量瓶内，用去离子水定容即可得到6%苯酚溶液。

配制葡萄糖标准溶液：称取0.200 g葡萄糖，溶于1 L的去离子水中配制成2 mg·mL-1的葡糖糖溶液，再吸取1 mL 2 mg·mL-1葡糖糖溶液，再加入9 mL去离子水配制成0.2 mg·mL-1的葡萄糖标准溶液。

绘制葡萄糖标准曲线：分别吸取葡萄糖标准溶液（0.2 mg·mL-1）0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL和1.0 mL置于10 mL试管中，加去离子水至补足体积为2.0 mL，再加6%的苯酚溶液1.0 mL，摇匀，迅速加入5.0 mL浓硫酸，再摇匀，随后室内放置30 min反应，反应结束后吸取200 μL待测液于96孔板中，并于490 nm处测定吸光度。计算加入葡萄糖溶液的浓度，以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标制作标准曲线。按上述方法进行多糖含量的测定，可根据葡萄糖标准曲线计算多糖浓度，进而计算多糖含量和多糖的提取率。

1.2.7 羊栖菜多糖抗氧化性能的检测

因提取的羊栖菜多糖浓度较高，故将提取得到的羊栖菜多糖提取物分别进行5倍和10倍的稀释，再进行抗氧化性能的检测。本实验使用到的抗氧化性能检测的方法有DPPH自由基清除测试法[14]和ABTS自由基清除测试法[15]。

DPPH是1，1-二苯基-2-三硝基苯肼的简称，是一种稳定的自由基，将其溶于乙醇溶液会呈深紫色，并且在517 nm附近有强吸收峰。当有自由基清除剂存在时，DPPH与自由基清除剂的单电子配对而使DPPH乙醇溶液褪色，导致光吸收减弱。因为DPPH乙醇溶液褪色程度与DPPH接受的电子数呈线性关系，可由此评价检测样品清除DPPH自由基的能力，从而得到检测样品的抗氧化活性。

ABTS法是利用显色剂ABTS在适当的氧化剂作用下会被氧化成绿色的ABTS+，ABTS自由基在波长734 nm有吸收峰，可在此波长下测定ABTS的吸光度得出样品的总抗氧化能力。本实验使用过硫酸钾（K2S2O8）作为氧化剂与ABTS反应直接生成稳定的阳离子自由基ABTS+，如果加入具有抗氧化性能的物质，则会与ABTS+发生反应，减少绿色的ABTS自由基的含量，从而使反应体系褪色。

式中：A0代表空白对照组吸光度；Ai代表检测样品吸光度。

2 结果分析

2.1 羊栖菜多糖提取效果

以去离子水为对照组，多糖含量为指标，在9种NADES提取试剂和去离子水中选取具有最优提取效果的NADES，结果如图1所示。从中可以看出，NADES-7对羊栖菜的提取效果最佳，提取率达9.39%，比去离子水高2.19%。

2.2 单因素实验

通过9种NADES和去离子水对羊栖菜多糖的提取效果可知，由左旋肉碱和苹果酸合成的NADES-7的提取效果最佳，故以NADES-7为提取试剂进行单因素实验，进一步提高羊栖菜多糖的提取效果，进而优化羊栖菜多糖提取工艺。

2.2.1 超声时间

在1∶20为料液比，NADES含水量为40%的实验条件下，探究不同超声时间对羊栖菜提取效果的影响，结果如图2所示。在固定料液比和提取试剂含水量的条件下，随着超声时间的增加，多糖的提取总体效率趋势呈现为先增后减，在40 min时达到峰值，故选取最佳超声时间为40 min。在20 min时其提取效率较10 min下降了0.19%，在误差范围内；在40 min之后增加超声时间提取率反而下降，有可能是超声导致多糖结构发生改变，影响多糖的提取效果。

2.2.2 料液比

在固定超声时间40 min，提取试剂的含水量为40%的实验条件下，探究不同料液比对多糖提取率的影响，结果如图3所示。从中可以看出，随着料液比的数值变化，加入的提取试剂逐渐增加，多糖的提取率总体趋势是上升的，在料液比达到1∶50时提取效率曲线趋于平缓。在图3中料液比1∶30较1∶20的多糖提取率下降了0.25%，在误差范围内，故建议选择料液比为1∶50。

2.2.3 含水量

作为多糖提取试剂，NADES存在一个问题，其黏度较高，限制了它在提取方面的应用。因此，为了降低黏度，采用不同含水量的NADES进行多糖的提取。不同的含水量会影响NADES的增溶能力以及反应效率，在NADES中加入水，可以调节NADES的黏度以及物理性质。当含水量过低时，NADES具有较高黏度，会阻碍其穿透细胞壁，影响提取效率。当水的含量在合适范围内，NADES的超分子复杂结构可以得以保留，而进一步稀释，结构则会被破坏，形成各组分的混合溶液，NADES在稀释过程中结构的逐渐变化会影响其理化性质和应用。

在固定超声时间为40 min，料液比为1∶50的实验条件下，探究不同NADES含水量对羊栖菜多糖提取效果的影响，结果如图4所示。随着NADES含水量的增加，NADES-7对羊栖菜多糖的提取效率先增加后减少，在50%出现峰值，提取率为13.82%，因此选择NADES含水量为50%。在NADES含水量为10%和20%时羊栖菜多糖的提取率相同，可能是NADES黏度较高，对多糖的提取效果无较大的差别。

2.3 羊栖菜多糖抗氧化性能的测定

羊栖菜多糖抗氧化性能如表2所示。从中可以看出，羊栖菜多糖对DPPH和ABTS自由基均具有良好的清除效率。尤其是在无稀释的情况下，羊栖菜多糖提取物对DPPH和ABTS自由基的清除率分别高达68.70%和98.89%，远高于5 μg·mL-1维生素C阳性对照组的43.27%和62.79%。随着稀释，羊栖菜多糖提取物的抗氧化性能显著下降。稀释5倍时，DPPH和ABTS的清除率分别只有8.47%和60.00%。而当稀释10倍时，羊栖菜多糖提取物的抗氧化性几乎可以忽略不记。

表2 DPPH或ABTS自由基的清除率表

3 结论

采用超声波辅助提取的方法，利用9种生物酸作为氢键供体与左旋肉碱作为氢键受体合成9种的NADES对羊栖菜进行多糖的提取，考察不同提取试剂提取羊栖菜多糖的效果，并进行单因素优化实验，考察超声时间、料液比和NADES的含水量对羊栖菜多糖提取效率的影响，并且后续将提取得到的羊栖菜多糖进行抗氧化性能的测定。结果表明，9种不同NADES对羊栖菜多糖提取具有良好的提取效率，其中由左旋肉碱和苹果酸合成制备的NADES-7对羊栖菜多糖的提取效果最佳，可达到9.39%。通过单因素实验得到NADES-7对羊栖菜多糖的最佳提取条件是超声时间为40 min、料液比为1∶50、NADES含水量为50 %，其提取率可达到13.82%。通过对优化提取工艺后的羊栖菜多糖进行抗氧化性能的测定，发现羊栖菜多糖具有较好的抗氧化性能，其中未进行稀释的羊栖菜多糖的浓度为0.008 64 g·mL-1，其对DPPH和ABTS自由基的清除率分别达到68.70%和98.89%，较阳性对照维生素C的清除率高1.5倍左右。两项自由基清除测试均表明提取的羊栖菜多糖具有很好的抗氧化性，由此羊栖菜多糖可以应用到食品、化妆品和生物医药等健康领域。