鄢腾峰 谈胤求 李云涛 徐 阳 刘宝辉 邓 刚 陈谦学

武汉大学人民医院神经外科 湖北 武汉 430060

紧密连接蛋白Claudins 是分子质量20～27 kU的蛋白家族，有27 个家族成员，具有4 个跨膜结构域和两个细胞外结构域（ECL1 和ECL2），这两个外结构域与嵌入质膜的⁃NH2 和⁃COOH 末端结合，能够维持细胞间完整性并调节细胞旁离子转运［1，2］。Claudins 蛋白家族成员的过表达或表达缺失，在慢性炎症和恶性肿瘤等疾病的病理过程中发挥着关键作用［3⁃5］。Claudins 蛋白家族通常作为紧密连接形成蛋白位于细胞膜上，它们通过同型结合形成复合物调节物质在细胞间的扩散［6］。本文主要就Clau⁃dins 蛋白家族中成员Claudin⁃4（CLDN4）在肿瘤中的表达和功能、核易位现象及作为肿瘤治疗靶点的研究进展进行综述，为进一步探索CLDN4 在肿瘤中的分子机制提供参考。

1 紧密连接的结构及功能

紧密连接（tight junctions，TJ）构成细胞间的最顶端结构，建立细胞极性并调节细胞间物质传递。紧密连接的结构和成分组成的细胞间黏附复合物，这种复合物能够维持细胞间连接，也能够选择性的调节水、离子、大分子的细胞旁途径物质交换，并能调节细胞膜内物质移动［7］。紧密连接蛋白CLDN4是Claudin 家族的重要成员，在各种类型肿瘤中广泛出现高表达或表达缺失。上皮⁃间质转化（epithelial⁃mesenchymal transition，EMT）既是细胞正常生理过程中的关键一环，又是癌症病理进展的重要步骤。从上皮过渡到间充质形态导致了细胞迁移能力的增强，这促进了肿瘤细胞向邻近组织的侵袭及转移。EMT 过程包括细胞紧密连接的丧失、细胞骨架重塑和形态变化［8］。紧密连接的丧失会导致细胞迁移和侵袭能力增强［9］。这些EMT 过程包括了上皮细胞黏附分子和紧密连接蛋白的下调［10］。Clau⁃dins 蛋白家族是高度保守的紧密连接的组成部分之一［11］。在癌症形成和发展过程中，细胞间紧密连接常被破坏，导致不受控制的肿瘤生长，恶性细胞从原发部位远处转移，从而导致癌症患者预后不良。此外，许多证据发现紧密连蛋白接既可以作为预后因素，也可以作为治疗靶点［12］。

2 CLDN4 在肿瘤中的表达及功能

CLDN4 蛋白过表达或表达缺失在多种肿瘤中被观察到。在具有淋巴结转移和高复发率的晚期乳腺癌中，CLDN1 和CLDN2 出现表达降低［13，14］，而在卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌和前列腺癌中出现了CLDN4 的过度表达［15］。在肾癌中，CLDN4 的核易位促进了Yes 相关蛋白（YAP）的核易位，YAP 与CLDN4 结合，从而诱导EMT 表型，EphA2 和PKC的磷酸化可能引起紧密连接障碍并从紧密连接释放CLDN4，可能增强与YAP 和闭锁小带蛋白1（ZO⁃1）的结合，形成核易位复合物，并可能是肾癌恶性的 机制之一［16，17］。表1显示了CLDN4 在不同肿瘤组织中的表达情况［15，18⁃34］。

表1 CLDN4 在肿瘤组织中的表达

在消化道肿瘤，CLDN4 在胃癌中高表达，与癌旁组织或胃上皮细胞相比，胃癌组织和细胞系中CLDN4 的表达显著升高，并可能是胃癌的独立预后因素［35］。TSPEAR⁃AS2 能够调节miR⁃1207⁃5p对CLDN4 的抑制作用，从而抑制胃癌的进展［36］。Song 等［28］得到了同样的结论，揭示了CLDN4 在胃癌中表达上调，CLDN4 的表达增强了胃癌细胞的增殖、侵袭和诱导胃癌细胞发生EMT，并与不良预后相关。此外，还有研究发现CLDN4 的下降增强了PI3K 和Akt 的磷酸化，并增强了胃癌细胞的增殖、迁移、侵袭以及胃癌肿瘤发生，并降低了细胞凋亡和胃癌细胞对化疗的敏感性［27］。在胰腺导管腺癌患者中，CLDN4 高表达与预后良好密切相关［37］。但高级别导管内乳头状黏液性胰腺癌CLDN4 的表达，明显高于低级别导管内乳头状黏液性胰腺癌［38］。CLDN4 低表达的食管鳞癌患者往往具有更差的预后［39］。在喉鳞状细胞癌中，CLDN4 表达下调，并且与甲基化CpG 结合蛋白⁃2（MeCP2）呈负相关，CLDN4 在喉鳞状细胞癌细胞中高度甲基化，CLDN4 抑制了喉鳞状细胞癌细胞细胞的迁移和侵袭，而CLDN4 敲低则恢复了细胞的迁移和侵袭［31］。同时，CLDN4 还可能成为消化道相关肿瘤诊断的分子标志物，如CLDN4 在胆管癌中强烈表达，而在肝细胞癌中则成阴性［40］。

在生殖系统肿瘤，卵巢癌中CLDN4 的研究也不统一，既发现有低表达［20］，也有高表达［19］。在非编码RNA 的调控中，Jie 等［18］发现ELFN1⁃AS1 能够通过作为miR⁃497⁃3p 的“海绵”促进CLDN4 的表达，从而在卵巢癌中发挥着癌基因的作用。CLDN4的过表达通过PI3K/Akt 和EMT 转录因子Twist1信号通路促进了卵巢癌细胞的EMT［41］。同样，也有研究表明卵巢癌患者高表达CLDN4 有着更差的预后［42］。在宫颈癌中，有研究表明随着宫颈病变恶性程度的增加，CLDN4 的阳性表达率也随之上升，使用CLDN4 和HR⁃HPV 共同检测能够提高诊断的特异性，表明CLDN4 的表达可能与宫颈癌及癌前病变的发生发展有关［30］。

CLDN4 对于非小细胞肺癌与上皮样恶性间皮瘤的区分，对比MOC⁃31 和Ber⁃EP4 具有更大的特异性［43］。研究发现BHLHE41 表达抑制了肿瘤细胞迁移和侵袭，尽管BHLHE41 通过MAPK/JNK 信号通路抑制MCF⁃7 细胞侵袭，并下调CLDN4 的mRNA 和蛋白表达，但它并不影响CLDN4 的细胞内定位［21］。

在乳腺癌中，P21 活化蛋白激酶4（PAK4）介导的CCAAT 增强子结合蛋白β（CEBPB）激活上调CLDN4 表达，促进了乳腺癌细胞的迁移和侵袭［22］。同样，有发现CLDN4 高表达的乳腺癌患者（包括接受了化疗患者）有着更差的预后［44］。但在乳腺原位癌中，CLDN4 低表达的患者有着更差的预后［45］，和E⁃cadherin 的表达结合可以更准确预测乳腺癌患者的预后［46］。

3 细菌毒素在CLDN4 靶向治疗中的研究

细菌毒素已逐渐成为癌症治疗的有效治疗选择。产气荚膜梭菌肠毒素（CPE）是具有选择性细胞毒性的成孔毒素，并且紧密连接蛋白CLDN3 和CLDN4 是 已 知 的 高 亲 和 力CPE 受 体［47］。CPE 与Claudins 蛋白的结合会触发膜孔复合物的形成，从而导致细胞快速死亡［48］。将表达CLDN4 的人前列腺癌细胞种植入小鼠，在小鼠前列腺癌异种移植物周围注射CPE 可显著抑制肿瘤的生长［49］。CPE 的C 端结构域能够增加和CLDN4 的结合［50，51］，这个特性使研究者更多选择了一种能与CPE 结合的融合基 因 靶 向CLDN4［52，53］，以 发 挥 更 大 的 细 胞 毒 性 作用。如CPE 与铜绿假单胞菌外毒素A（ETA）融合，产生免疫毒素（CPEETA'），在头颈鳞状细胞癌和乳腺癌中研究了这种免疫毒素抑制CLDN4 阳性癌细胞增殖的能力，并进一步证明CPEETA'对MCF⁃7乳腺癌和HN5 头/颈癌细胞系非常有效，而对HeLa细胞（CLDN4 阴性）则没有细胞毒性作用。同时，免疫毒素随后在肿瘤定植菌株梭状芽胞杆菌中表达。最重要的是，厌氧梭状芽胞杆菌能够过表达和分泌CPEETA'融合蛋白，这个发现为厌氧梭状芽胞杆菌分泌高浓度免疫毒素靶向递送到肿瘤部位治疗CLDN4 阳性癌细胞提供了可能性［54］。在结直肠癌中，CLDN3 和CLDN4 过表达的结肠癌株系显示出对pCpG⁃optCPE 表达载体（optCPE）的高度敏感性，导致携带人类患者源性结肠癌异种移植物的小鼠体内肿瘤生长受到抑制，并伴随肿瘤内optCPE表达而导致大量坏死［48］。有趣的是，有研究表明使用无毒部分CPE（C⁃CPE）和化疗药物联合处理膀胱癌细胞，能够增加RT4 细胞对丝裂霉素C 和达沙替尼的敏感性［55］。在卵巢癌中，对C⁃CPE 敏感的卵巢癌细胞，对紫杉醇和卡珀的剂量依赖更低［56］。但是，在口腔鳞状细胞癌中，研究发现39%病例显示CLDN4 表达在核中，并且与CLDN4 阴性病例相比，CLDN4 阳性病例与癌症进展的相关性更强。CPE 使CLDN4 在人口腔鳞状细胞癌细胞系HSC3和HSC4 核易位增多，并增强了肿瘤EMT、干性、细胞增殖和侵袭能力［57］。

4 CLDN4 在肿瘤耐药中的研究

有研究报道，CLDN4 在在三阴性乳腺癌中的表达高于非三阴性乳腺癌，并且发现紧密连接在三阴性乳腺癌中保留了乳酸，从而降低了肿瘤内的pH值。在小鼠模型中，使用抗CLDN4 细胞外结构域抗体（4D3）削弱了乳腺癌细胞紧密连接的屏障功能，增强了紫杉醇的抗癌作用［58］。CLDN4 在食管鳞状细胞癌干细胞中上调，高表达CLDN4 的食管鳞状细胞癌细胞具有更强干性并导致肿瘤在顺铂化疗中耐药，导致了患者预后差。同时硫胺四氢糠基二硫化物（TTFD）降低了食管鳞状细胞癌细胞中的CLDN4 表达并减弱了干性［29］。在胰腺导管癌中，4D3 以剂量依赖的方式增强了5⁃氟尿嘧啶（5⁃FU）诱导的生长抑制，4D3 抑制了肿瘤紧密连接更大消除了肿瘤屏障，促进了5⁃FU 化疗药渗透入肿瘤微环境，从而增强5⁃FU 的抗肿瘤作用，联合用药后小鼠也并未发生不良反应［59］。在胃癌中，Nishi⁃guchi 等［60］发现4D3 和顺式二甲基二氯铂（CDDP）处理可协同抑制细胞增殖，并比单独使用顺式二甲基二氯铂处理更大程度地增加肿瘤坏死和细胞凋亡。同样，在大肠癌中，该团队用4D3 和抗上皮生长因子受体（EGFR）抗体C225 的联合治疗在裸鼠中抑制肿瘤生长，裸鼠模型中，相较于同时治疗，以6 h 时间间隔连续治疗4D3 和C225 导致对肿瘤生长的抑制作用更为明显，先使用4D3 处理肿瘤，让4D3对肿瘤的屏障作用破坏后，再使用C225 能够将诱导EGFR 磷酸化作用更强，以发挥最大的抗肿瘤作用［61］。令人鼓舞的是，该研究团队在膀胱癌中研究中，发现在皮下肿瘤和肺转移的小鼠模型中，联合4D3 治疗可增强顺铂抑制肿瘤生长的效果［62］。在肝细胞癌中，ZNF703 能够通过直接与CLDN4 启动子结合，激活CLDN4 的表达诱导EMT 从而促进肿瘤转移和索拉非尼耐药［26］。除此以外，抗CLDN4 单克隆抗体IgG1（KM3934）以剂量依赖性方式增强其细胞毒性，并在小鼠体内显著抑制胰腺癌和卵巢癌异种移植物的肿瘤生长［63］。

5 总结及展望

在CLDN4 没有发生核易位时，Sasaki 等［59］和Nishiguchi 等［60］发明了4D3 可能通过引起肿瘤间紧密连接CLDN4 蛋白的结构分解，降低了癌症的屏障功能，使化疗药物更容易渗透入肿瘤区域，从而提高化学疗法的有效性。Rambabu 等［64］基于同源建模方法构建了人CLDN4 的三维结构，并基于此筛选出了多个分子可能能与CLDN4 的活性位点结合，并在细胞毒性实验中使用可能分子充当抑制剂，发现对乳腺癌（MCF7）和肺癌（A549）癌细胞系具有抑制作用。因此，抗CLDN4 抗体作为一种新型的分子靶向药物具有潜在的应用前景，能够增强现有药物的作用效用。使用CPE 的无毒部分和化疗药物联合使用，已经证明对正常细胞破坏更小［55］。鉴于CPE 的高效率，并且潜在危险小，对于高表达CLDN4 的肿瘤有着非常重要的潜在应用价值。癌细胞中紧密连接分子对EMT 诱导的存在，可能由于它们以组织特异性和癌症特异性方式起作用，现在对其了解依然甚少。综上所述，继续深入探究CLDN4 分子机制，对于肿瘤的分子治疗有着十分重要的意义。