李 雷 杨名珠 周庆儒 邱瑞琪 雷 博

年龄相关性黄斑变性(AMD)是世界范围内50岁以上人群视力损害的主要原因，AMD的发病率随着年龄的增长而增加。据估计，到2040年，全球AMD患者的数量将达到3亿[1]。目前，临床上认为慢性炎症、氧化损伤和内质网应激是导致AMD的主要原因[2]。脂质，如胆固醇、三酰基甘油和低密度脂蛋白(LDL)，在视网膜变性中起着重要的作用，特别是在AMD发展的早期和中期阶段[3]。氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)是LDL的氧化修饰产物，不能通过LDL受体途径代谢[4]。ox-LDL改变了脂质代谢、氧化应激、炎症以及细胞凋亡相关基因的转录，可能与AMD的发病机制有关[5]。

在哺乳动物的视网膜中有三种胶质细胞：Müller细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞。其中，小胶质细胞是视网膜的常驻巨噬细胞，其在中枢神经系统和视网膜疾病的发生发展中起着重要作用[6]。像外周血中的单核细胞一样，小胶质细胞活化后可以极化为两种主要亚型：“经典激活”的M1型和“选择性激活”的M2型，M1型主要起到促进炎症发生的作用，M2型主要与抑制炎症和修复有关。M1型和M2型细胞的数量变化可以引起不同的反应，在AMD患者中，最初以M2型细胞为主，起到炎症修复的作用，随着病情进展，促炎因子增多使得M1型细胞增多，炎症反应扩大[7]。

Toll样受体-4(TLR-4)是Toll样受体家族中的一员，在调节炎症反应中发挥重要作用，它可以激活下游MyD88和TRIF两个不同的信号通路[8]。其中，MyD88可以增加核转录因子(NF)-κB的表达[9]。我们先前的研究发现，ox-LDL可以导致视网膜发生炎症反应和新生血管形成[5]。抗血管内皮生长因子(VEGF)治疗是目前临床实践中治疗AMD的主要方法，但部分患者疗效不佳[10]。因此，更好地了解AMD的早期发病机制是找到新的治疗方法的必要条件。本研究的目的是探讨ox-LDL诱导的视网膜形态和功能损伤是否和TLR-4/MyD88通路激活以及小胶质细胞极化相关。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂扫频源光学相干断层扫描仪(视微影像科技有限公司，河南)，视觉电生理仪(艾尔曦医疗设备有限公司，重庆)，双光子激光共聚焦显微镜(蔡司公司，德国)。人源ox-LDL(奕源生物技术公司，广州)，反转录试剂盒(Takara 生物技术有限公司，北京)，TUNEL检测试剂盒、4,6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)(碧云天生物技术有限公司)，β-actin (CST 公司，美国)，离子钙结合适配器分子1(Iba-1)抗体(Abcam公司，美国)，TLR-4抗体(Santa Cruz公司，美国)，二抗(MILLIPORE 公司，美国)，iNOS抗体、CD206抗体(赛维尔生物科技有限公司，武汉)，MyD88抗体、荧光二抗(Cell Signaling Technology公司，美国)，BCA蛋白试剂盒(Beyotime，上海)。

1.2 动物实验

1.2.1 实验动物与分组8周龄雄性C57BL/6小鼠(杰克森实验室，美国)40只，体重(19±1) g，维持12 h/12 h 的光-暗循环，并提供充足的食物和水。实验中尽量减少动物的不安和不适。随机分为实验组和对照组两组，每组各20只，均以右眼为实验眼。所有涉及动物的实验程序都按照ARVO关于在眼科和视觉研究中使用动物的声明进行。

1.2.2 视网膜下注射实验组小鼠右眼视网膜下注射1 μL ox-LDL，对照组小鼠右眼视网膜下注射1 μL 磷酸盐缓冲液(PBS)。ox-LDL浓度根据课题组前期实验结果设置为100 mg·L-1[7]。小鼠腹腔注射体积分数1.25%三溴乙醇麻醉，复方托吡卡胺滴眼液散瞳。使用30号胰岛素针的针头在巩膜的锯齿缘下方穿刺造孔，将32号汉密尔顿注射器插入孔内，注意避免损伤晶状体，在解剖显微镜下将1 μL ox-LDL或PBS注射到视网膜下间隙，以注射区域看到视网膜下水泡样脱离表明注射成功。所有动物均使用左氧氟沙星眼膏涂眼预防感染，注射后每日观察。

1.2.3 OCT检测视网膜下注射 2周后，两组各随机取10只小鼠，同1.2.2方法麻醉、散瞳后行OCT检查，记录视神经外1个视盘直径距离的视网膜外核层(ONL)和内核层(INL)厚度。根据文献[11]，使用视网膜ONL与INL的比值作为评价光感受器损伤情况的指标。

1.2.4 ERG检测视网膜下注射2周后，两组各随机取10只小鼠适应黑暗环境过夜。第2天，同1.2.2方法麻醉、散瞳后行ERG检测，所有操作均在暗红光下进行。暗适应刺激强度为从-3～1 log cd·s·m-2，明适应刺激强度为0 log cd·s·m-2和1 log cd·s·m-2，记录a波和b波的振幅。

1.2.5 小鼠视网膜qPCR检测视网膜下注射 2周后，两组各随机取10只小鼠颈椎脱位法处死，取右眼，分离出视网膜并匀浆。用Trizol试剂从视网膜中提取总RNA，反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA。用 SYBR Green Master Mix 对得到的cDNA进行扩增，β-actin 为内参。反应程序为50 ℃ 2 min，之后95 ℃ 2 min 40个循环，95 ℃ 15 s和60 ℃ 1 min。实验重复3次。使用 2-ΔΔCt对数据进行处理。引物序列： Iba-1上游引物为5’-GATTTGCAGGGAGGAAAAGCT-3’，下游引物为5’-AACCCCAAGTTTCTCCAGCAT-3’；TLR-4上游引物为5’-GCCGTTGGTGTATCTTTG-3’， 下游引物为5’-GCTGTTTGCTCAGGATTC-3’；MyD88：上游引物为5’-AACAGAAGCGACTGATTCC-3’，下游引物为5’-TCATTGAACACGGGTTGAG-3’；CD206 上游引物为5’-CTCTGTTCAGCTATTGGACGC-3’，下游引物为5’-CGGAATTTCTGGGATTCAGCTTC-3’；iNOS 上游引物为5’-CAAGCACCTTGGAAGAGGAG-3’，下游引物为5’-AAGGCCAAACACAGCATACC-3’；β-actin：上游引物为5’-ATCACTGCCACCCAGAAG-3’，下游引物为5’-TCCACGACGGACACATTG-3’。

1.2.6 小鼠视网膜Western blot检测视网膜下注射 2周后，两组各随机取4只小鼠颈椎脱位法处死，取右眼，分离出视网膜并匀浆，用含有10 g·L-1蛋白酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液在冰上裂解30 min，4 ℃ 12 000 r·min-1离心15 min，收集上清。BCA蛋白试剂盒测定蛋白浓度。样品用5×SDS上样缓冲液稀释，100 ℃煮沸5 min。等量的总蛋白在135 g·L-1的SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离，转移到聚偏二氟乙烯膜上。用体积分数5%脱脂牛奶封闭膜1.5 h，4 ℃下分别与Iba-1(1200)、TLR-4(1400)、MyD88(1100)一抗孵育过夜，二抗(110 000)在室温下轻轻摇动PVDF膜2 h。ECL试剂盒显影曝光，使用ImageJ软件分析，以β-actin为参照。实验重复3次。

1.2.7 小鼠视网膜免疫荧光染色检测视网膜下注射2周后，两组各取剩余的6只小鼠颈椎脱位法处死，摘出右眼，室温下用40 g·L-1多聚甲醛固定 4 h，然后用不同浓度的蔗糖溶液在4 ℃下脱水。在冰冻切片机上通过角膜-视神经轴线切厚6 μm的连续切片。阻断液为以PBS为溶剂的50 g·L-1牛血清白蛋白和体积分数0.3%的Triton X-100。洗涤液以体积分数0.1% Tween 20溶解在PBS中制备。将载玻片放置在暗盒中，室温下加入阻断液1 h。一抗Iba-1(1200)、iNOS(1200)、CD206(1200)4 ℃下过夜，室温下加入荧光结合的二抗(15000)1 h。

1.2.8 小鼠视网膜TUNEL染色检测TUNEL染色按照试剂盒说明书进行，取1.2.7切片，在室温下用4,6-二氨基-2-苯基吲哚对细胞核染色。在相同的曝光和增益条件下获得图片，用ImageJ软件分析。

1.3 细胞实验

1.3.1 细胞的培养与分组人视网膜色素上皮(RPE)细胞系ARPE-19细胞购自美国模式菌种收集中心(ATCC,Manassas,VA,美国)。使用含体积分数10%胎牛血清、10 g·L-1青霉素和链霉素的DMEM/F12培养基，置于37 ℃、体积分数5% CO2培养箱中培养。随机分为ox-LDL组(培养基中加入100 mg·L-1ox-LDL处理24 h)和PBS组(培养基中加入等体积的PBS处理24 h)。

1.3.2 ARPE-19细胞的qPCR检测ox-LDL组和PBS组ARPE-19细胞分组处理24 h后，2.5 g·L-1胰蛋白酶消化，离心，收集细胞后，行RNA的提取、反转录以及扩增，方法同动物实验。引物序列：TLR-4上游引物为5’-AGACCTGTCCCTGAACCCTAT-3’，下游引物为5’-CGATGGACTTCTAAACCAGCCA-3’；MyD88上游引物为5’-CTAAGAAGGACCAGCAGAG-3’，下游引物为5’-GAAGCATCAGTAGGCATCA-3’；β-actin上游引物为5’-TCACTATTGGCAACGAGCGGTTC-3’，下游引物为5’-CTCCTGCTTGCTGATCCACATCTG-3’。实验重复3次。

1.3.3 ARPE-19细胞的Western blot检测细胞分组处理24 h后，PBS洗涤2次，用含有1 g·L-1蛋白酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液在冰上裂解30 min，余方法同动物实验，其中一抗为TLR-4(1400)、MyD88(1100)。使用ImageJ软件分析，β-actin为参照。实验重复3次。

1.3.4 ARPE-19细胞的TUNEL染色ARPE-19细胞分组处理24 h后， PBS清洗，于40 g·L-1多聚甲醛中固定30 min。再次PBS清洗后，在黑暗条件下用含有体积分数0.1% Triton X-100的冷PBS孵育细胞2 min。TUNEL反应缓冲液在37 ℃加湿室中避光孵育细胞1 h，PBS洗3次。荧光显微镜下拍照，ImageJ软件分析。

1.4 统计分析结果用均数±标准差表示，采用GraphPad Prism 7软件进行统计分析。ERG数据采用双因素方差分析和Bonferroni校正，其余结果用非配对t检验进行分析。检验水准：α=0.05。

2 结果

2.1 ox-LDL提高小鼠视网膜中TLR-4和MyD88表达小鼠视网膜下注射2周后，qPCR和Western blot检测结果显示， 与对照组相比，实验组小鼠视网膜中TLR-4和MyD88的mRNA和蛋白表达水平均升高(均为P<0.01)(图1)。

图1 qPCR和Western blot检测两组小鼠视网膜中TLR-4和MyD88的mRNA和蛋白表达 A：qPCR检测结果(**P<0.01，***P<0.001)；B：Western blot检测结果。

2.2 ox-LDL激活小鼠视网膜小胶质细胞小鼠视网膜下注射2周后，qPCR和Western blot检测结果显示，与对照组相比，实验组小鼠视网膜中Iba-1的mRNA和蛋白表达水平均显著升高(均为P<0.05)。免疫荧光染色检测结果显示，与对照组相比，实验组小鼠Iba-1阳性细胞数显著增加(图2)。

图2 qPCR、Western blot和免疫荧光染色检测两组小鼠视网膜中Iba-1的mRNA和蛋白表达 A：免疫荧光染色结果；B：qPCR检测结果(**P<0.01)；C：Western blot检测结果。

2.3 ox-LDL诱导小胶质细胞M1极化视网膜下注射2周后，qPCR检测结果显示，与对照组相比，实验组小鼠视网膜中M1表型标志物iNOS的mRNA表达水平升高(P<0.001)，而M2表型标志物CD206的mRNA表达水平变化不明显(P>0.05)。免疫荧光染色检测结果显示，与对照组相比，实验组iNOS阳性细胞增加，而CD206阳性细胞数无明显差异(图3)。

图3 qPCR和免疫荧光染色检测两组小鼠视网膜中iNOS 和CD206的mRNA和蛋白表达 A：免疫荧光染色结果；B：免疫荧光染色结果的平均光密度分析(***P<0.001)；C：qPCR检测结果(***P<0.001)。

2.4 ox-LDL损伤小鼠视功能ERG检测结果显示，与对照组相比，实验组小鼠视网膜的a波和b波振幅均明显下降(均为P<0.001)(图4)。

图4 ERG检测两组小鼠视网膜功能 A：ERG结果；B：暗适应a波振幅统计结果(***P< 0.001)；C：明适应b波振幅统计结果(***P< 0.001)；D：暗适应b波振幅统计结果(***P<0.001)。

2.5 ox-LDL损伤小鼠视网膜形态OCT检测结果显示，与对照组(4.0±0.2)相比，实验组(3.0±0.1)小鼠视网膜的ONL/INL比值下降(P<0.01)。TUNEL染色结果显示，与对照组相比，实验组小鼠视网膜中TUNEL染色阳性细胞数增加，细胞凋亡数量增加，且细胞凋亡主要发生在ONL(图5)。

图5 两组小鼠视网膜形态 A：OCT检测；B：TUNEL染色结果。

2.6 ox-LDL提高ARPE-19细胞TLR-4和MyD88表达并诱导细胞凋亡qPCR和Western blot检测结果显示，与PBS组相比，ox-LDL组ARPE-19细胞TLR-4和MyD88的mRNA和蛋白表达水平均明显升高(均为P<0.01)。TUNEL染色结果显示，与PBS组相比，ox-LDL组ARPE-19细胞的TUNEL染色阳性细胞数显著增加(图6)。

图6 两组ARPE-19细胞凋亡及TLR-4和MyD88的mRNA和蛋白表达情况 A：qPCR检测结果(**P< 0.01，***P<0.001)；B：Western blot检测结果；C：TUNEL染色结果；D：TUNEL染色结果分析(***P<0.001)。

3 讨论

ox-LDL引起小胶质细胞的激活与AMD的炎症和发病机制有关[12-13]。本研究参考文献[5]的报道，使用ox-LDL处理ARPE-19细胞和小鼠，以模拟AMD的病理过程，分析其中可能的机制，结果显示，ox-LDL可活化小胶质细胞，诱导其向促进炎症发生的M1型极化，并引起光感受器细胞凋亡和视功能障碍；ox-LDL导致的视网膜损伤可能与TLR4/MyD88通路的激活有关。

在之前的研究中我们发现，ox-LDL可以通过激活P2X7R/NLRP3/caspase-1通路上调炎症因子白细胞介素1β(IL-1β)的表达，并增加NF-κB的表达，说明ox-LDL可以引起视网膜炎症反应[5]。本实验中，我们用ox-LDL处理ARPE-19细胞和C56BL/6小鼠进一步证明了NF-κB的激活可能与上游TLR-4/MyD88通路相关，推测该通路可能参与了AMD的发病。

炎症反应是AMD的重要发病因素，而小胶质细胞在此过程中发挥重要作用[12,14]。在正常情况下，小胶质细胞作为视网膜中的常驻免疫细胞位于丛状层，而在炎症状态下，小胶质细胞增殖并迁移至损伤部位。在急性炎症期，小胶质细胞活化引起的神经炎症可以促进神经保护和再生过程，并促进组织稳态的快速恢复。炎症持续的情况下，如视网膜退行性疾病，小胶质细胞会被病理性激活并释放大量的炎症介质，造成组织损伤和疾病恶化[15]。小胶质细胞在视网膜遗传性疾病、感染以及创伤时会引起视网膜神经节细胞和光感受器细胞的退化，小胶质细胞的激活与视网膜炎症和退行性疾病的发生发展密切相关[6]。我们在小鼠视网膜中检测了小胶质细胞激活的标志物Iba-1的表达，在视网膜下注射ox-LDL后，Iba-1阳性细胞的数量增加。

同外周循环的单核细胞相似，小胶质细胞在活化后发生极化反应，其极化后主要分为M1和M2两种亚型，M1型主要起到促进炎症发生的作用，M2型主要与抑制炎症和修复有关。一些促炎细胞因子，如IL-1β，可以激活并极化小胶质细胞为M1型[7]。既往研究表明，AMD小鼠模型和细胞模型中IL-1β的表达增加[5]。我们检测了小胶质细胞的极化情况，结果显示，视网膜下注射ox-LDL 2周后，小鼠视网膜中的小胶质细胞被激活并极化为M1型，我们推测活化的M1型小胶质细胞是ox-LDL引起炎症反应的重要一环，与之前的文献报道一致[14,16]。

ERG检测结果显示，无论是在暗适应还是明适应情况下，实验组小鼠视网膜的a波和b波振幅均显著下降。a波反映光感受器细胞的功能，b波反映双极细胞和Müller细胞的功能。OCT检测结果显示，与对照组相比，实验组小鼠视网膜ONL/INL比值显著下降。此外，TUNEL染色结果显示，实验组小鼠视网膜中细胞凋亡主要发生在ONL。结合ERG的结果， 我们推测ox-LDL主要损伤视网膜感光细胞层。

RPE层是光感受器和脉络膜毛细血管之间的代谢屏障，在维持视网膜功能中起着关键作用。另外，RPE细胞也会向视网膜下间隙中分泌数种抑制性细胞因子，维持视网膜免疫抑制状态[17]。RPE细胞损伤被认为是AMD的触发因素之一[18]。我们之前的研究表明，ox-LDL导致人RPE细胞中促炎因子和活性氧的增加[5]。因此，我们推测ox-LDL可能通过激活上游TLR-4/MyD88通路，进而激活NF-κB引发炎症反应[5]。NF-κB上调pro-IL-1β和NLRP3的转录，之后将NLRP3、pro-caspase-1和caspase招募域(ASC)组装为多蛋白复合物。P2X7R激活引起的K+外排能够激活这种多蛋白复合物，将pro-caspase-1转化为caspase-1。在caspase-1激活后，pro-IL-1β被裂解为IL-1β并分泌到细胞外，介导炎症反应[19-20]。RPE层的损伤和IL-1β等炎症因子的增加可能是使小胶质细胞被激活并极化为M1型的重要原因。而M1型小胶质细胞会进一步促进多种炎症因子释放，如IL-1β和肿瘤坏死因子-α，加重炎症反应[7]。此外，M1型小胶质细胞高表达iNOS，诱导细胞产生大量一氧化氮，从而导致代谢性缺氧和活性氧的释放[21]。这些结果也与本课题组前期的实验结论相一致[5]。

本研究提供了ox-LDL可能激活视网膜中TLR4通路和活化小胶质细胞的证据，但仍存在悬而未决的问题。TLR-4是脂多糖的结合靶点，虽然有报道ox-LDL受体LOX-1与TLR-4的激活呈正相关[22]，但其具体调控机制尚不清楚，值得进一步研究。

综上，我们发现ox-LDL引起的视网膜功能和形态的损伤可能与激活TLR-4/MyD88通路，并导致小胶质细胞活化和极化为M1表型有关。本研究加深了对ox-LDL介导的视网膜炎症反应的了解，为深入认识AMD的发病机制提供了实验依据。