张 莉 汤加勇 贾 刚 田 刚 刘光芒 陈小玲 蔡景义 赵 华

(四川农业大学动物营养研究所，动物抗病营养教育部重点实验室，农业农村部动物抗病营养与饲料重点实验室，动物抗病营养四川省重点实验室，成都 611130)

作为节粮型草食性动物，家兔是我国畜牧业重要组成部分。家兔肠道健康是制约其生产的重要原因之一，使用抗生素在抑制肠道有害菌生长的同时也抑制有益菌生长，造成肠道微生物菌群失调，且诱发更多的耐药菌，危害生态环境。随着饲料行业禁抗的推行，寻找代替抗生素提高家兔抗病能力的饲用添加剂是促进兔业持续发展的有效途径之一。抗菌肽是一类广泛存在于生物体内的阳离子两亲性小分子多肽，通常由12～100个氨基酸组成，具有耐热、耐酸碱、广谱抗菌和不易产生耐药性等特点[1]。根据来源可分为细菌抗菌肽、植物抗菌肽、昆虫抗菌肽、水生抗菌肽、动物抗菌肽等；根据结构特点可分为蛙皮类、防御素类、天蚕类和蜂毒类等。抗菌肽是动物非特异性免疫的重要成分，同时在体液免疫中也起着重要作用，且不同抗菌肽其抗菌范围不同。鲶鱼抗菌肽parasin Ⅰ是从受伤鲶鱼上皮黏膜中分离得到，由19个氨基酸组成[2]，具有高效杀菌效果且无溶血性，其抗菌效果是蛙皮素maganin 2的12～100倍，是蟾蜍胃抗菌肽buforin Ⅰ的8倍[3]。研究发现，鲶鱼抗菌肽parasin Ⅰ可抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌等有害菌的生长[4]。抗菌肽主要作用于细胞壁、细胞膜和细胞内的分子效应器，其在进入动物肠道后可有效抑制有害菌的生长并促进有益菌的生长，促进肠道对营养物质的吸收，从而改善动物生长性能和肠道健康[5]。

目前，在猪、禽和反刍动物上的研究均表明抗菌肽可提高牲畜生长性能，改善肠道微生物组成，促进肠道健康[6-7]，而在家兔上的研究相对较少。生物蛋白API为本课题组成功设计表达的包含鲶鱼抗菌肽parasin Ⅰ功能片段的基因工程蛋白，其对家兔的生长性能及肠道健康等是否有效还有待进一步研究。因此，本试验旨在研究饲粮中添加不同水平API在对肉兔生长性能、空肠消化酶活性、盲肠发酵产物及微生物组成以及空肠紧密连接蛋白和免疫细胞因子相关基因相对表达量的影响，为其在家兔饲粮中的应用提供理论数据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

API为本实验已构建的毕赤酵母阳性菌株表达的上清液，伊拉商品肉兔购自雅安市天全县华联兔业农民专业合作社。

1.2 试验设计

选取30日龄健康且体重[(644.93±31.92) g]相近的断奶伊拉商品肉兔144只，根据平均体重随机分为4组，每组18个重复，每个重复2只兔。对照组饲喂基础饲粮，试验组在基础饲粮中分别添加0.1、0.5和1.0 mg/kg API。试验期8周。基础饲粮参照NRC(1994)营养需要进行配制，饲粮类型为4.0 mm颗粒料。基础饲粮组成及营养水平见表1。

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)

续表1项目 Items含量 Content磷酸氢钙 CaHPO41.00氯化钠 NaCl0.30预混料 Premix1)0.50合计 Total100.00营养水平 Nutrient levels2)消化能 DE/(MJ/kg)10.34粗蛋白质 CP16.01粗脂肪 EE4.25淀粉 Starch16.29粗纤维 CF15.27中性洗涤纤维 NDF33.49酸性洗涤纤维 ADF18.75酸性洗涤木质素 ADL4.26钙 Ca0.92总磷 TP0.54有效磷 AP0.41赖氨酸 Lys0.82蛋氨酸+半胱氨酸 Met+Cys0.52苏氨酸 Thr0.62

1.3 饲养管理

肉兔饲养试验在四川农业大学动物营养研究所教学科研基地进行。试验前清洗兔舍和用具并用甲醛进行熏蒸消毒。肉兔饲养于3层金属笼中，兔舍温度控制在15～22 ℃，相对湿度66%～78%，自然采光并保证适宜通风，每天饲喂5次(07:30、10:00、13:00、15:00、18:30)，自由饮水。

1.4 样品采集与指标测定

1.4.1 生长性能与健康状况

试验期间，以重复为单位，记录各组肉兔每周的给料量、废料量和余料量；分别于第1天、第28天和第56天对肉兔空腹称重。计算各组肉兔平均日采食量(ADFI)、平均日增重(ADG)和料重比(F/G)。每日观察并记录肉兔腹泻和死亡情况，计算肉兔腹泻率、死亡率和健康风险指数[8]。

1.4.2 样品采集

饲养试验结束后，按平均体重选取24只健康肉兔(每组6只)，屠宰后立即取出盲肠，用pH计(PHSJ-3D)测定盲肠食糜pH，取前、中、后3处测定后计算平均值。同时快速分离肠段，取空肠黏膜、盲肠食糜于冻存管中，置于液氮中保存备用。

1.4.3 空肠消化酶活性测定

空肠黏膜的淀粉酶、脂肪酶和胰蛋白酶活性均采用南京建成生物工程研究所试剂盒测定，操作步骤严格按试剂盒说明书进行。

1.4.4 盲肠发酵产物及微生物组成测定

盲肠食糜中的挥发性脂肪酸(volatile fatty acid，VFA)含量用CP-3800型气相色谱仪测定，氨态氮(NH3-N)含量用比色法测定[9]。盲肠食糜微生物总DNA采用粪样DNA提取试剂盒(No.D4015-01，Omega)提取，用SYBRTMGreen染色法(No.RR820A，TaKaRa，10 μL体系)对总菌和大肠杆菌数量进行检测，用TaqMan法对乳酸杆菌数量进行检测。

1.4.5 空肠紧密连接蛋白和免疫相关基因mRNA相对表达量测定

采用RNAiso Plus(No.9109，TaKaRa)提取空肠黏膜总RNA，用PrimeScriptTMRT reagent Kit(No.RR047A，TaKaRa)把RNA反转录为cDNA；用SYBR®Primix Ex TaqTMⅡ (No.RR820A，TaKaRa，10 μL体系)对紧密连接蛋白[封闭蛋白-1(Claudin-1)、闭锁小带蛋白-1(ZO-1)、闭锁小带蛋白-2(ZO-2)]和免疫相关基因[(白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-10(IL-10)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)]进行实时荧光定量(QuantStudio 6，ABI)PCR，以β-肌动蛋白(β-actin)作为内参基因，结果采用2-△△Ct法计算分析。定量引物序列用Primer Express 3.0设计，并送至上海生工生物公司合成。

1.5 数据处理与统计分析

试验数据采用Excel 2013进行初步整理，对发病率、死亡率和健康风险指数进行计算，应用SPSS 22.0统计软件对其他指标进行单因素方差分析和Duncan氏法多重比较。结果用平均值±标准误表示，统计显著性水平为P<0.05。

2 结 果

2.1 API对肉兔生长性能和健康状况的影响

由表2可知，饲粮中添加API对肉兔末重、ADFI、ADG和F/G无显著影响(P>0.05)。与对照组相比，饲粮中添加API可降低肉兔腹泻率，0.1 mg/kg API组腹泻率降低了39.99%，0.5和1.0 mg/kg API组腹泻率均降低了30.02%；饲粮中添加1.0 mg/kg API可降低肉兔死亡率和健康风险指数，分别降低了37.49%和33.34%。

表2 API对肉兔生长性能和健康情况的影响

2.2 API对肉兔盲肠发酵产物和微生物组成的影响

由表3可知，与对照组相比，饲粮中添加0.1 mg/kg API可显著提高盲肠丙酸比例(P<0.05)；饲粮中添加0.5和1.0 mg/kg API对盲肠丙酸比例无显著影响(P>0.05)，但在数值上有所降低。饲粮中添加API对盲肠pH、NH3-N含量、总挥发性脂肪酸含量、乙酸比例和丁酸比例无显著影响(P>0.05)；但饲粮中添加0.5和1.0 mg/kg API组盲肠NH3-N含量在数值上均低于对照组，且盲肠NH3-N含量随饲粮中API添加水平增加而降低。与对照组相比，饲粮中添加API可降低盲肠大肠杆菌数量，其中1.0 mg/kg API组盲肠大肠杆菌数量显著降低(P<0.05)。饲粮中添加API对盲肠总菌和乳酸杆菌数量无显著影响(P>0.05)。

表3 API对肉兔盲肠发酵产物和微生物组成的影响

2.3 API对肉兔空肠紧密连接蛋白相关基因mRNA相对表达量的影响

由图1可知，与对照组相比，饲粮中添加API可提高空肠Claudin-1的mRNA相对表达量，且空肠Claudin-1的mRNA相对表达量随饲粮中API添加水平增加而升高，其中1.0 mg/kg API组显著升高(P<0.05)。饲粮中添加API对空肠ZO-1和ZO-2的mRNA相对表达量无显著影响(P>0.05)。

2.4 API对肉兔空肠免疫相关基因mRNA相对表达量的影响

由图2可知，与对照组相比，饲粮中添加API可提高空肠IL-2的mRNA相对表达量，其中0.5和1.0 mg/kg API组显著升高(P<0.05)。饲粮中添加API对空肠IL-6、IL-10和TNF-α的mRNA相对表达量无显著影响(P>0.05)。

2.5 API对肉兔空肠消化酶活性的影响

由表4可知，与对照组相比，饲粮中添加1.0 mg/kg API可显著提高空肠淀粉酶活性(P<0.05)；饲粮中添加0.1、0.5和1.0 mg/kg API均可显著提高空肠脂肪酶和胰蛋白酶活性(P<0.05)，其中空肠脂肪酶活性分别提高了97.81%、49.07%、45.59%，空肠胰蛋白酶活性分别提高了41.16%、57.26%、55.50%。

数据柱标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，相同或无字母表示差异不显著(P>0.05)。下图同。

图2 API对肉兔空肠免疫相关基因

3 讨 论

动物生产中大量使用抗生素降低动物自身免疫力并干扰肠道菌群稳态，抗生素残留导致有害菌耐药性提高。因此，在饲料禁抗后，研发无毒副作用的饲用抗生素替代物是畜牧业当前重要的任务之一。有研究发现，饲粮中添加适量抗菌肽具有促进动物生长和改善健康的作用。其中，抗菌肽plectasin可促进肉鸡生长性能[10]，抗菌肽PBD-ml和LUC-n可提高山羊饲料利用率，改善生长性能[6]。也有研究表明抗菌肽对正常生理状态下仔猪的生长性能无显著影响[11]，但能显著提高大肠杆菌攻毒条件下断奶仔猪的ADG[12]。本研究发现，饲粮中添加API对肉兔生长性能无显著影响，有不同程度降低腹泻率的作用，当添加高水平(1.0 mg/kg)API时，其健康风险指数最低。这表明API对肉兔的健康状况有一定的改善作用，本结果与复合抗菌肽CAP提高仔猪抗病能力和降低腹泻率结果[13]相类似。

表4 API对肉兔空肠消化酶活性的影响

肉兔腹泻主要原因是肠道菌群紊乱，其中盲肠中大肠杆菌是引起腹泻的主要细菌之一。抗菌肽MccJ 25可减少肉鸡肠道内大肠杆菌的数量，增加乳酸杆菌和双歧杆菌的数量[14]；也有研究表明抗菌肽可抑制有害菌的生长，但对有益菌的生长无显著影响[15]。本研究中，随着饲粮中API添加水平的增加，肉兔盲肠大肠杆菌的数量逐渐降低，表明API能很好地抑制大肠杆菌的生长。同时，盲肠微生物生长繁殖与NH3-N和VFA密切相关。因为NH3-N是盲肠内微生物生长的氮源，其含量降低有利于抑制有害菌的繁殖[16]；VFA(包含乙酸、丙酸和丁酸)是微生物分解碳水化合物的产物，能反映微生物发酵能力且具有抗炎抗菌的作用[17]。本研究发现，饲粮中添加0.5和1.0 mg/kg API降低了盲肠NH3-N含量，饲粮中添加0.1 mg/kg API提高了盲肠丙酸比例，这预示着API有提高肉兔盲肠微生物发酵能力的作用。以上结果表明，饲粮中添加中、高水平(0.5和1.0 mg/kg)API在一定程度上可降低盲肠NH3-N含量，降低微生物生长的氮源，从而抑制大肠杆菌生长，改善盲肠的微生物菌群结构，进而降低肉兔的腹泻率和死亡率。

肠上皮机械屏障是防止有毒物质入侵机体的屏障之一，肠上皮细胞旁间隙由连接复合体封闭，其最重要的组成结构是紧密连接蛋白，如Claudin-1、ZO-1和ZO-2。Claudin-1与肠上皮离子转运通道的形成相关，对维持肠上皮细胞屏障的完整性及其功能至关重要[18]。ZO-1是紧密连接蛋白的骨架蛋白，常作为评价肠道屏障功能和通透性的指标[19]。紧密连接蛋白mRNA相对表达量的减少可导致膜通透性增加，从而破坏肠道屏障功能。本研究发现，饲粮中添加API可上调肉兔空肠Claudin-1的mRNA相对表达量，且一定程度地上调ZO-1、ZO-2的mRNA相对表达量，与前人的研究结果[20]一致。这表明API的摄入在一定程度上可降低空肠上皮通透性，改善其机械屏障功能，改善肠道健康，从而上调了紧密连接蛋白的表达。

抗菌肽在肠道中除增强机械屏障作用外，还有增强肠道黏膜免疫屏障的作用[21]。肠道不仅是机体的消化器官，也是机体重要的免疫器官。IL-2可增强T细胞的杀伤活性，对细胞介导的免疫反应至关重要；IL-6具有促进体液免疫的作用[22]。在鱼类上的研究发现，抗菌肽hepcidin对斑马鱼肝脏、脾脏、肾脏的IL-2表达均有调节作用[23]。抗菌肽sublancin可提高小鼠脾脏IL-2的表达[22]。本研究中，饲粮中添加不同水平API均可上调肉兔空肠IL-2和IL-6的mRNA相对表达量，且显著上调IL-2的mRNA相对表达量，这表明API的摄入可通过抑制肠道有害菌的生长来增强肠道的免疫屏障功能，改善肠道健康，从而上调了免疫因子的表达。

淀粉酶、胰蛋白酶和脂肪酶是小肠中主要的消化酶，其活性的高低可反映动物对营养物质的消化能力。肠道消化酶活性和肠道屏障完整性、肠道微生物平衡之间密切相关。本试验中，饲粮中添加不同水平API可不同程度地提高肉兔空肠淀粉酶、脂肪酶和胰蛋白酶活性，这与抗菌肽surfactin提高罗非鱼肠道消化酶活性研究结果[24]一致。这表明API的摄入在一定程度上改善了肠道健康，从而提高了肠道的消化酶活性。在本研究中，API的摄入可通过抑制肠道有害菌的生长来增强肠道的机械屏障和免疫屏障功能，从而改善肠道健康，提高肠道消化酶活性，促进对营养物质的消化吸收。

4 结 论

饲粮中添加API虽然对肉兔生长性能无显著影响，但可抑制盲肠大肠杆菌生长，改善盲肠微生物平衡；饲粮中API添加水平在1.0 mg/kg时，肉兔的健康风险指数最低，空肠Claudin-1、IL-2的mRNA相对表达量最高，空肠淀粉酶和胰蛋白酶活性也相对较高。因此，在本试验条件下，饲粮中API添加水平为1.0 mg/kg时对肉兔的肠道健康改善效果最佳。