郑凤长 熊海科 赵海龙 朱小康 薛继军 袁继宝 李莹 陈静 朱自江

甘肃省肿瘤医院，甘肃 兰州730050

区域癌化理论证实病理形态结构正常但Lugol’s染色异常的食管上皮即是食管上皮中的癌化区域，此区域中必然存在食管鳞癌早期的基因改变［1，2］。基于这一理论基础，我们初步建立了食管癌早期癌化区域与食管癌组织、正常食管组织间差异表达的基因文库，用于进行后期研究工作。抑制性消减杂交技术（SSH）是基于抑制性PCR 的未知差异表达基因筛选技术，目前已广泛应用于差异表达基因的筛选，SSH 具有快速、高效、高特异性、高敏感性的优点。本研究探讨应用SSH法筛选获得的CRNN 基因在早期食管癌变中的潜在价值，并初步评估其在早期食管癌发生发展中的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取我院2016 年1～12 月病理诊断的食管癌鳞癌切除标本。纳入标准：无其他恶性肿瘤既往病史、未接受放疗或化疗，且癌组织距上切缘大于5cm 的患者标本。排除标准：上切缘阳性或存在其他病理类型标本、患者拒绝收集标本者。共纳入符合要求患者标本68 例，对标本进行Lugol's 液染色处理。

1.2 组织标本收集 食管癌切除标本离体20 分钟内进行取材。纵向剖开食管腔，用医用生理盐水充分喷洗食管黏膜，喷洒Lugol's 液，5 分钟后用医用生理盐水洗去食管黏膜表面Lugol's 液后观察染色情况。依次收集主癌灶、主癌灶外Lugol's 液染色阳性区及正常食管黏膜染色区的小片或点状食管黏膜，将所取标本分为三份，其中一份用于病理诊断（取10%中性福尔马林溶液适量，固定组织，石蜡包埋后4 μm 切片，HE 染色）；其余两份立即置入液氮装置保存，后转入-80℃冻存。通过对68 例患者标本进行Lugol's 液染色，将15 例病理表型正常、存在主癌灶以外Lugol's 液染色阳性区的组织纳入研究中。

1.3 试剂和仪器 主要试剂：0.25%胰蛋白酶（Hyclone J140032），30%丙烯酰胺（Solarbio A1010），4×蛋白上样缓冲液（Solarbio P1016，Agarose Qxoid），BCA 蛋白定量试剂盒（Solarbio P1510），DEPC 水（Beyotime R0021），NNN N-四甲基乙二胺（TEMED）（Sigma WX13B2984V），PrimeScript RT Master Mix（TaKaRa RR036A），RIPA Lysis Buffer（普利莱基因技术有限公司C1053），RNA Marker（Invitrogen RL6000），RNAiso Plus（TaKaRa SD1410），YBR Premix Ex Taq Ⅱ（TaKaRa RR820A），蛋白质Marker（Therm 26616），甘氨酸（Glycine）（Solarbio G8200），过硫酸铵（AP）（天津永晟精细化工公司20130428），辣根酶标记山羊抗兔lgG（北京中杉金桥FL-335），磷酸盐缓冲液（PBS）（Solarbio 509E025），十二烷基磺酸钠（SDS）（Sigma 323A033），胎牛血清（Wisent 86150021）。

主要仪器：超纯水系统（Milli-Q Advantage），小型制冰机（SIM-f140 SANYO），台式高速冷冻离心机（eppen dorf Centrifuge 5810R），台式高速冷冻离心机（eppendorf Centrifuge 5417R），超微量分光光度计（ND2000 Thermo），超净工作台（苏州华宇 HS-840），PCR 仪（Bio-rad MyCycler），石蜡切片机（SLEE CUT4062），全自动组织包埋机（Sakura Finetek Japan Co.5232），全自动组织脱水机（Sakura Finetek Japan CO.VIP-5Jr-J2），电动显微镜（0LYMPUS IX81），恒温水浴锅（郑州南北仪器HH-4），恒温金属浴（Eppendorf 5352），电泳仪（BioRad Mini Protean Tetra），半干转印系统（BioRad Trans-Blot SD），凝胶成像仪（BioRad CHEMI DOC XRS+），电热恒温培养箱（上海新苗DNP-9052BS-Ⅲ），超低温冰箱（Haier DW-86W420），快速混匀器（江苏新航仪器SK-1）。

1.4 方法 Real-Time PCR 检测食管鳞癌组织、区域组织及正常组织CRNN RNA。

1.4.1 RNA 的提取。将收集的食管鳞癌手术切除标本癌组织、区域组织、正常组织，分别标记为Ca、L（+）、L（-）。①从-80℃取出组织样本，称重，每份样本取100mg；将组织置于2mL RNase free 离心管中，冰上剪碎，加入1mL RNAiso Plus，1 枚钢珠，置于组织匀浆仪（钢珠及组织匀浆仪经-80℃预冷30min），50Hz 4min；将离心管从组织匀浆仪上取下，冰上静置5 min 充分裂解；12 000×g，4℃，离心10min；将液体转入1.5mL RNase free 离心管，室温静置10min；加入200μL 的氯仿，剧烈震荡30s，室温静置5min；12 000×g，4℃，离心10min；将上层液相转入新的同种离心管中；加入同体积异丙醇，充分震荡混匀，静置10 分钟；12 000×g，4℃，离心15 分钟，可见乳白色沉淀于管底；弃液体，加入1mL 的75%乙醇洗涤沉淀，12 000×g，4℃，离心1 分钟；小心除去盖玻片，用滤纸吸去血清，滴加一抗（兔抗人单克隆抗体，1 ∶200 稀释），用盖玻片加封，37℃孵育2h；弃液体，超净工作台中空气干燥RNA 沉淀后溶解于50μL DEPC处理水中，取5μL 小样用于检测RNA 完整性。②RNA完整性鉴定：封闭：PAP 笔画圈，加血清后用盖玻片加封，孵育37℃20min。③RNA 浓度及纯度分析：小心除去盖玻片，用滤纸吸去血清，滴加一抗（兔抗人单克隆抗体，1 ∶200 稀释），用盖玻片加封，37℃孵育2h。

1.4.2 cDNA 合成。取上一步得到的RNA，将浓度调整在450～500ng/μL 之间进行cDNA 合成。PrimeScript RT Master Mix 2μL、RNA 1μL、DEPC-treated water 7μL。涡旋混匀30s，离心1 min，置于PCR 仪上，37℃15min，85℃5s，4℃。将产物储存于-20℃，待Real-Time PCR用。

1.4.3 Real-Time PCR。实验准备：以β-actin 为管家基因，引物由TaKaRa 公司设计合成，序列如下：

用DEPC-处理水将引物溶解，并配置成100 μM的储备液，10μL 分装，-20℃保存，取一份储备液稀释至20μM 用于Real-Time PCR。①按TaKaRa 公司SYBR*Premix Ex Taq Ⅱ试剂盒说明建立反应体系：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ10μL、PCR Forward Prime r0.2μL、PCR Reverse Primer 0.2μL、cDNA 1μL、DEPC-treated water 8.6μL。②置于Real-Time PCR 仪上，按照设定程序进行反应。③实时荧光定量PCR 结果分析。采用Livak 法计算mRNA 的相对表达量，计算公式为：CT=CT目的基因-CT 管家基因；△△CT=△CT 实验组-△CT 空白对照组；2-△△CT表示实验组目的基因表达量相对于正常对照组表达量的倍数关系。

1.5 统计学分析 采用SPSS 22.0 统计软件进行数据分析，定量资料采用（±s）表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD 法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RNA 的提取 本次实验所提取的RNA 完整性高、质量好，无降解，无蛋白质等污染。见表1。

表1 RNA浓度与纯度

2.2 Real-Time PCR 结果 以CRNN mRNA 在正常食管黏膜组织表达量为对照，将其均数设置为1，在区域组织、食管鳞癌组织中的表达量与在正常食管黏膜表达量的比值即为相对表达量，统计结果显示CRNN基因在食管鳞癌组织与正常食管黏膜组织中的相对表达量差异具有统计学意义（P＜0.05）、在区域组织与正常食管黏膜组织中相对表达量差异也具有统计学意义（P＜0.05）。见表2、图1、2、3。

表2 CRNN mRNA 在三组组织中的表达

图1 CRNN 溶解曲线

图2 CRNN 扩增曲线

图3 食管组织中CRNN mRNA 的表达

3 讨论

目前普遍认为，食管癌是一种由多因素共同作用、多种基因参与、多个阶段发展的恶性肿瘤，其发生、发展与多种基因表达相关。通过研究肿瘤组织与正常组织、瘤旁组织或不同病理分期、发展阶段之间的基因差别，挖掘差别基因功能及其在癌变过程中的作用，是研究肿瘤发生、发展的重要手段，避免了全基因组表达差异研究面临的一个问题，即得到一大批差异表达的基因，往往是数十至数百之多，由于所得到的基因数量过大无法处理。

抑制消减杂交技术［3-5］是在PCR 技术基础上出现的，是通过抑制性PCR 的未知差异表达基因筛选技术，其首先通过消减杂交使有丰度差异的单链DNA 得到均衡，再通过抑制性PCR 使目标基因得以富集。目前广泛应用于差异表达基因的筛选，较之其他方法，其具有以下特点：①特异性高。通过两次消减杂交和PCR，选择性扩增目的cDNA 片段、抑制非目的cDNA 片段，提高了差异基因的检出率。②灵敏度高。与基因芯片技术相比，SSH 技术通过平衡cDNA 丰度，完整保留低丰度差异基因，避免过量分离高丰度差异基因，利于稀少基因的表达。③快速、高效。数天内即可完成，每次可同时分离几十至几百个差异基因。④操作简单。实验方法简单、技术成熟、对设备要求低。

目前，抑制性消减杂交技术在肿瘤相关基因的研究中已体现出重要的价值，尤其在肝癌、肾癌、前列腺癌、食管癌、骨肉瘤的差异基因研究中。DongXY 等［3］采用SSH 技术，构建了一例原发性肝癌患者肝癌组织与癌旁肝脏组织的差异基因文库，筛选出差异基因19 个，其中已知基因17 个。Choi SY 等［4］对直肠癌细胞与相应的正常直肠细胞进行抑制性消减杂交，发现与肿瘤相关高表达的已知基因9 个，刘洁薇等［5］应用SSH 技术，成功构建了人大细胞肺癌高低转移细胞株差异基因文库，筛选出与肿瘤相关基因6 个，其中5 个与肿瘤侵袭、转移有关。既往对于肿瘤差异表达基因的筛选，多是从肿瘤组织、正常组织或肿瘤组织、瘤旁组织、正常组织之间筛选，因肿瘤组织与瘤旁组织或正常组织之间在基因水平上差异很大，且差异基因很难说明肿瘤发展的时序性。因此，我们选择食管癌组织、癌化区域与正常食管黏膜组织，进行抑制性消减杂交，筛选差异基因，癌化区域是比不典型增生更早的癌前病变，通过癌化区域与正常食管黏膜组织、食管癌组织差异基因的研究，能从中找出真正的食管癌早期基因，或在食管癌发生、发展中有重要作用、更具代表性的基因。

通过Real-Time PCR 法检测CRNN 在食管鳞癌组织、癌化区域组织及正常食管黏膜组织中的表达。Real-Time PCR 检测CRNN mRNA 的表达，从mRNA 水平进行验证。该方法检测结果所显示的表达趋势是，CRNN基因在食管鳞癌组织和正常食管黏膜组织中的表达具有差异性，在癌化区域组织与正常食管黏膜组织中表达具有差异性，而且CRNN 基因在正常食管黏膜、癌化区域组织及食管鳞癌组织中的表达依次降低，这与抑制消减杂交结果是一致的。同时也验证了区域癌化理论，而我们所筛选的差异表达基因可作为食管鳞癌早期基因备选基因进行后续研究。

CRNN 位于染色体1q21 区段，含有4 个外显子，共编码495 个氨基酸，CRNN 蛋白N 端含一个Ca2+结合结构域及EF 手性结构域，C 端含有两个谷氨酰胺和苏氨酸富含的60 个氨基酸的重复序列。CRNN 是表皮分化复合物基因家族的一个新成员，与表皮终末分化密切相关［6］，在头颈部鳞癌［7］、口腔鳞癌［8］、宫颈鳞癌中低表达［9］，目前研究已证实，CRNN 与食管癌的发生和发展相关，在食管鳞癌中表达明显下调，其表达与食管癌的分化程度呈正相关，在体外和体内试验的功能性研究表明，CRNN 在食管鳞癌细胞中有很强的肿瘤抑制能力。通过上调Rb 和P21 表达，将细胞周期阻滞在G1/S 从而起到抑制肿瘤的作用［10］。通过RNA 干扰沉默CRNN 表达可以达到有效地抑制肿瘤作用［10］。在食管黏膜抵抗病原微生物入侵、热与酸性食物刺激以及上皮细胞分化的过程中发挥着重要作用。多因素分析表明，CRNN 的下调是食管鳞状细胞癌的独立预后因素［11］。

Li GM 等［12］通过实验研究证实，CRNN 在人类正常鳞状上皮高表达，在食管鳞癌中低表达，这与本研究结果是相吻合的。进一步研究发现S100 结构域是CRNN 发挥功能的关键结构域，它可以通过多聚化更好地保护细胞，通过核磁共振、超速离心、凝胶过滤层析、质谱分析和蛋白质交联分析，发现S100 结构域具有钙依赖的多聚性质，而多聚体的形成更有利于保护细胞免受脱氧胆酸和乙醇的损伤，这也从微观上证实了CRNN 是抵制环境压力和保持组织完整性的应激蛋白之一。

骆爱萍等［6］通过cDNA 微阵列方法研究显示CRNN在食管鳞癌中的表达明显下调，通过对110 例食管鳞癌组织标本、配对的食管鳞状上皮组织中CRNN 表达与食管鳞癌临床、病理指标的相关性研究表明，CRNN表达与食管鳞癌的分化程度呈正相关，说明CRNN 可能与食管鳞癌细胞分化缺陷相关。通过对CRNN 启动子区转录因子AP-1、HSF 及CEBP 的结合位点的研究，AP-1 家族成员：Fra1、c-Fos 及c-Jun，HSF 家族成员：HSF1 与HSF2，转录因子Fra1、c-Fos、c-Jun、HSF1、HSF2 及CEBP 的表达呈正相关，化疗药物致食管鳞癌细胞DNA 损伤因素可诱导CRNN 及转录因子Fra1、c-Fos、c-Jun 及CEBP 表达，而这些转录因子与细胞应激反应、细胞分化、增殖及DNA 损伤相关，表明CRNN与食管鳞癌的发生与发展密切相关。Chen K 等［13］利用cDNA 微阵列分析显示，CRNN 在食管鳞癌组织中明显下调，不论是mRNA 水平还是蛋白水平，且与临床分期、淋巴结转移及总生存率相关。多变量分析结果表明CRNN 下调是食管鳞癌预后的独立因素。通过对食管鳞癌细胞的研究，CRNN 主要是通过上调P21WAF1/CIP1 和Rb 的表达，将细胞周期阻滞G1/S 作用点而起到肿瘤抑制作用。进一步通过RNA 干扰沉默CRNN表达，能有效地抑制其肿瘤抑制作用。张薇等［14］通过对CRNN 基因遗传多态性的研究，共发现SNP 位点6个，携带-1139CC 基因型者患食管鳞癌的风险明显升高，表明CRNN 基因遗传多态性与食管鳞癌发病发现相关。CRNN 在食管黏膜抵病原微生物入侵、各类外界刺激以及上皮分化的过程中发挥着重要的作用。

目前国际上已有研究证明在食管标本中，碘染色不着色但病理表现正常的黏膜组织仍存在DNA 水平的基因突变，提示这种组织是较不典型增生更早的食管鳞癌癌前病变。了解这种组织与真正食管正常上皮间在基因水平上的差别，无疑是发现食管鳞癌早期基因的一条捷径。本研究通过SSH 技术成果构建了食管鳞癌、癌化区域与正常食管黏膜的消减杂交cDNA 文库。通过对差异基因和cDNA 片段进行筛选，选择CRNN 对其进行mRNA 临床验证，通过实验，完成了预期目标。然而，在食管鳞状细胞癌早期基因生物学效应及功能的研究方面，仍有大量工作要做，在实验完整性上还存在不足，将在后期工作中进一步深入研究。