李岩 刘娅楠 李文娟 吕理浇 刘志汉 赵晓红 张凌云 薛建军

(1甘肃省中医药研究院，甘肃 兰州 730050；2甘肃省中医院麻醉科；3甘肃中医药大学)

急性肢体缺血是指各种原因导致的肢体灌注减少，并可能危害肢体活力，其中主要的发病原因是缺氧〔1〕，常见于止血带使用时间过长、血栓、肢体急性创伤的等。急性肢体缺血除了可引起远端肢体的缺血损伤外，还可通过内分泌-免疫机制引起全身脏器的损伤〔2〕。在缺血后的再灌注阶段液体转移进入周围组织间隙，血管松弛因子如一氧化氮生成减少导致血管阻力增加，同时血管本身也通过抑制血管扩张和促进血管收缩的自我调节来应对全身炎症反应，其结果周围动脉血管强烈收缩，导致外周器官缺血缺氧并形成恶性循环〔3〕。缺血再灌注损伤时通常伴有全身炎症反应，中性粒细胞募集激活补体级联系统，炎症细胞因子如肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞黏附分子和选择素进入血循环并引发全身性补体级联反应的激活〔4〕，因此缺血再灌注损伤的主要机制是大量的氧自由基释放及复杂的细胞因子级联风暴，使远端器官的炎症反应及氧化应激持续产生，临床上可表现为多器官功能障碍，如急性肾衰竭和急性肺损伤，除此以外，肝脏也被认为是潜在的受累器官，其中炎症和氧化应激是主要的损伤机制〔5〕，因此，抗炎和抑制氧化被认为是减轻急性肢体缺血再灌注导致的肝损伤的重要途径。

当归是一种多年生草本植物，由于其具有营养、补血和抗炎等作用，已广泛应用于心血管疾病、肝纤维化和风湿性疾病的治疗中。当归多糖(AP)是当归中最重要的生物活性成分，具有促进造血功能、免疫调节、抗肿瘤等生物学功能〔6,7〕。有研究发现AP可以抑制脂多糖(LPS)诱导的脊髓细胞凋亡和炎症，保护细胞活性〔8〕。此外有研究显示AP通过抑制核因子(NF)-κB及双面激酶/信号传导及转录激活因子(AK2/STAT3)通路调节HT22细胞中miR-10a水平，减轻LPS诱导的炎性损伤〔9〕。然而对于AP对肢体缺血再灌注后肝损伤的保护效应，目前尚无相关研究。为了进一步对AP的生物学效应进行研究，本文通过构建大鼠肢体缺血再灌注后肝损伤模型，探究AP减轻大鼠肢体缺血再灌注后肝损伤及潜在机制。

1 材料与方法

1.1实验材料

1.1.1实验动物 健康SPF级雄性SD大鼠60只，2月龄，购于甘肃中医药大学实验动物中心，伦理编号为：2018-102。大鼠雄性体重150～200 g，生产许可证号SCXK(甘)：2019002，大鼠在SPF环境下适应性饲养3 d，常规饮食，自由饮水。

1.1.2试剂 戊巴比妥钠(用生理盐水配制为1%溶液)，Tris·HCl缓冲液，4%多聚甲醛溶液，1%四氧化锇等均购自兰州科宝实验器材有限公司；甲基丙二醇(MPO)试剂盒购自美国Sigma-Aldrich公司；血清肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β试剂盒购自美国R&D公司；TUNEL试剂盒购自上海碧云天生物有限公司；NF-κB抗体和Nrf2抗体均购买自美国CST公司。

1.1.3仪器 电子天平，恒温水浴锅，低温离心机，全自动酶标仪均购自美国Thermo公司，722紫外可见分光光度计和DH164电热恒温鼓风干燥箱购自上海君恒医疗。

1.1.4受试药物 AP购自MCE公司(中国)，为果胶酶法提取，利用苯酚-硫酸法测定得率约25%，经兰州大学药理学教研室鉴定符合药典规定，质量合格，药物纯度99%，批号N-30SIK2。

1.2实验动物及分组

1.2.1实验分组 将60只大鼠按随机数字表法随机分为6 组：正常对照组(不做任何缺血处理，只灌胃给予生理盐水)、模型组、阳性对照组(依达拉奉)，AP低剂量组，AP中剂量组、AP高剂量组，每组10只。

1.2.2AP给药处理 AP的临床给药剂量为20 mg/kg，参照《药理实验方法学》〔10〕附录里有关于各种动物之间给药剂量换算系数的表，根据相应的系数计算，大鼠AP各剂量组灌胃剂量分别以50 mg/kg、100 mg/kg和200 mg/kg，用生理盐水配制，每天1次(早晨9∶00)。阳性对照组依达拉奉以3 mg/kg灌胃，正常对照组、模型组用等量无菌生理盐水灌胃处理。各组均连续灌胃7 d。灌胃期间每日严格观察并记录大鼠的生理状况、活动状况。

1.2.3肢体缺血再灌注损伤造模 用药7 d后开始缺血再灌注损伤造模，造模前所有大鼠禁水2 h，1% 戊巴比妥钠(25 mg/kg)腹腔注射麻醉，将麻醉完毕的大鼠四肢和头部束缚于自制鼠板上，左后肢脱毛后，根部环扎橡皮筋夹闭左后肢股动脉，造成左后肢缺血，缺血2 h后，立即松开橡皮筋持续灌注6 h后再标本取样。大鼠均采用相同弹性强度的橡皮筋，缺血时间和再灌注时间均严格控制，保证实验对象间的均一性。

1.2.4标本采集和处理 各组大鼠，心脏采血4 ml；全血离心(4℃，1 000 r/min，离心20 min)后分装血清，-20℃冰箱冻存，用于生化分析。收集血液后，解剖大鼠，迅速取肝脏，置于冰冻生理盐水中反复漂洗，滤纸吸干，精密称量脏器的重量，计算肝脏指数，肝脏指数=肝脏重量/大鼠体重×100%。取小块肝脏组织保存于4%的多聚甲醛溶液中固定24 h，常规石蜡包埋切片，其余冻存于-80℃冰箱。

1.2.5MPO检测 肝脏匀浆的制备方法：采用三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris·HCl)50 mmol/L，pH7.4制备肝匀浆。MPO检测时，在96孔细胞板中加入待测血清20 μl或者肝脏组织匀浆液20 μl，加入200 μl过氧化氢反应液，然后加入200 μl显色液(茴香胺反应液)65℃ 反应30 min，在酶标仪中波长 420 nm下测定各孔的OD值，并根据标准品曲线计算各孔MPO水平。

1.2.6检测血清TNF-α、IL-1β水平 TNF-α,IL-1β水平主要运用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测，ELISA 操作主要步骤：用已经将TNF-α或IL-1β抗体吸附在固相载体的表面的试剂盒，加入相应血清反应30 min后，TBST洗板，加入TNF-α或IL-1β抗体反应2 h后，TBST洗板，加入酶的耦联物反应30 min后洗板，最后加入酶相应的底物，反应显色。颜色的深浅与固相载体上的抗原/抗体呈正比，用酶标仪读取吸光度，带入标准曲线中计算，即得所检测因子的浓度。

1.2.7肝脏形态学检测 4%的多聚甲醛溶液中固定24 h，常规石蜡包埋切片，石蜡切片脱蜡。切片充分脱蜡和水化后，将切片入苏木素染3～8 min，蒸馏水洗，1%的盐酸酒精分化数秒，蒸馏水冲洗，0.6%氨水返蓝，流水冲洗。切片入伊红染液中染色1～3 min染细胞质将切片依次放入95%酒精Ⅰ 5 min-95%酒精Ⅱ 5 min-无水乙醇Ⅰ5 min-无水乙醇Ⅱ5 min-二甲苯Ⅰ5 min-二甲苯Ⅱ5 min中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片，显微镜镜检，图像采集分析。

1.2.8TUNEL染色 4%的多聚甲醛溶液中固定24 h，常规石蜡切片，切片充分脱蜡和水化，依次将切片放入二甲苯Ⅰ10 min-二甲苯Ⅱ10 min-无水乙醇Ⅰ5 min-无水乙醇Ⅱ5 min，然后切片水化：95%酒精5 min-90%酒精5 min-80%酒精5 min-70%酒精5 min-蒸馏水洗反应充分、均匀。蛋白酶k孵育20 min细胞通透，加入TUNEL 37℃ 反应30 min，加入二氨基联苯胺(DAB)反应10 min后磷酸盐缓冲液(PBS)充分清洗，显微镜镜检并拍照，图像采集分析。

1.2.9Western印迹检测 肝脏组织利用液氮粉碎组织块，加入RIPA缓冲液和蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟(PMSF)震荡匀浆，冰上孵育30 min，4℃ 14 500 r/min离心15 min，上清液为组织裂解液，加等体积的2×电泳加样缓冲液，沸水浴中6 min，电泳上样，电转膜仪转膜，然后经过封闭，一抗孵育过夜，二抗孵育2 h后，Western印迹试剂盒显色，分析比较记录。

1.3统计学分析 采用SPSS21.0软件进行方差分析、独立样本t检验、LSD-t检验。

2 结 果

2.1各组大鼠身体情况和肝脏指数比较 实验过程中各组大鼠无死亡情况和明显的体重降低情况。造模后模型组大鼠夹闭左后肢股动脉后血管搏动消失，肢体苍白伴有挛缩，2 h后松开橡皮筋后，血管搏动恢复。实验中大鼠麻醉后均苏醒，模型组及药物治疗的造模大鼠均出现不同程度的精神萎靡，弓背，毛发耸立，而正常对照组无上述症状。

模型组肝脏指数明显高于正常对照组(P<0.01)，表明模型组大鼠肝脏充血明显增多。阳性对照组、AP各剂量组肝脏指数较模型组显著降低(P<0.05，P<0.001)，提示肝脏充血损伤减轻。AD高、中剂量组较AP低剂量组肝脏指数降低，差异有统计学意义(P<0.05)，而AP中剂量组和高剂量组肝脏指数无统计学差异，提示AP对肝脏充血损伤具有一定的改善作用，但并未呈现剂量依赖式增加，而是具有一定的浓度域。见表1。

2.2各组大鼠肝损伤病理比较 模型组肝脏充血明显，局部肝脏细胞片状坏死，伴有肝脏细胞脂肪变性、水泡样变性及炎症反应，肝细胞损伤明显，表明模型组大鼠存在明显的肝脏损伤。在阳性对照组肝脏充血坏死明显改善，仅可见少许肝脏脂肪样变及炎细胞浸润。AP各剂量组肝脏中细胞坏死同样较模型组改善，炎症细胞浸润减少，仅表现为部分肝脏细胞水泡样变。见图1。

表1 AP对大鼠肝脏指数及TUNEL阳性细胞相对数量的影响

图1 各组大鼠肝脏HE染色结果(×200)

2.3各组大鼠肝细胞凋亡水平比较 模型组大鼠肝脏组织中TUNEL染色阳性细胞较对照组显著增多(P<0.01)，表明模型组肝脏细胞凋亡明显。阳性对照组肝脏细胞TUNEL染色阳性细胞数量较模型组明显较少(P<0.01)，表明依达拉奉对肝细胞具有一定的保护作用，可明显降低肝细胞凋亡水平。AP各剂量组肝脏细胞TUNEL阳性细胞较模型组明显减少(P<0.05，P<0.01)，表明AP处理后的大鼠肝细胞凋亡减少，提示依达拉奉及AP处理后，大鼠肢体缺血再灌注所致的肝细胞凋亡水平改善。见表1、图2。

2.4各组大鼠血清MPO、TNF-α、IL-1β水平比较 模型组血清MPO水平明显高于对照组(P<0.01)。各给药组血清中MPO水平较模型组明显降低(P<0.05，P<0.01)。模型组TNF-α,IL-1β水平显著高于对照组(P<0.01)，各给药组TNF-α,IL-1β水平较模型组显著降低(P<0.05，P<0.01)。AP中剂量组的MPO、TNF-α、IL-1β水平较AP低剂量组明显降低，而AP剂量组和高剂量组MPO、TNF-α、IL-1β水平无统计学差异(P>0.05)。见表2。

2.5大鼠肝脏组织中HO-1/Nrf2及TLR4/NF-κB通路激活水平 与正常对照组比较，模型组NF-κB表达升高，Nrf2下调，差异有统计学意义(P<0.01)。各给药组与模型组比较，NF-κB表达下调的同时Nrf2表达升高，差异有统计学意义(P<0.01)，见表2、图3。

图2 各组大鼠肝细胞凋亡水平比较(TUNEL，×200)

表2 AP对大鼠血清MPO、TNF-α、IL-1β的影响及HO-1/Nrf2、TLR4/NF-κB通路的激活

1～6：正常对照组，模型组，阳性对照组，AP低剂量组，AP中剂量组，AP高剂量组图3 AP对HO-1/Nrf2及TLR4/NF-κB通路的激活

3 讨 论

急性肢体缺血再灌注损伤期间，缺血组织释放大量的炎症因子及代谢产物进入血液循环，如肌酸酐磷酸激酶、肌红蛋白、乳酸脱氢酶及钾离子会干扰整个机体并导致炎症反应，从而使肝脏、肺等非缺血器官发生炎症反应，甚至多器官衰竭〔4〕，对于肾脏，血浆肌红蛋白过量会导致肾小球的小动脉闭塞，诱发急性肾衰竭〔11〕，对于肺脏，急性肢体缺血损伤导致的系统性炎症反应使血管通透性的增加，从而导致肺水肿〔12〕，对于远端肢体缺血再灌注后各器官的易损程度，研究发现各个器官均易导致再灌注损伤，且组织之间再灌注损伤的严重程度没有差异〔13〕，因此这一研究提示在肢体缺血再灌注后，应仔细监测远端各脏器的功能。本研究结果显示，当大鼠远端肢体缺血再灌注后，可引起肝脏明显的充血，产生氧化应激，诱发机体炎症反应，导致大鼠肝脏细胞凋亡增加，本研究的大鼠肝损伤表型也与相关研究结果一致〔14,15〕。

虽然改善血流(再灌注)是克服肢体缺血的重要方法，然而，不适当的再灌注可触发促炎介质的激活和活性氧(ROS)的形成，诱发全身炎症反应综合征和多器官功能障碍综合征〔16〕，因此抑制氧化应激和炎症反应是改善肢体缺血再灌注损伤的重要途径，有研究发现给予肢体缺血再灌注大鼠模型生物碱千金藤素(Cepharanthine)后，由于Cepharanthine可抑制肿瘤坏死因子TNF-α介导的NF-κB激活，实验中缺血再灌注模型大鼠的氧化应激水平和炎症反应明显降低〔17〕。AP具有众多的生物学效应，AP目前已被证实在调节炎症中具有一定的作用，研究发现AP给药后不仅增强了巨噬细胞对抗原的摄取，也显著提高了特异性免疫球蛋白(IgG)免疫应答和细胞因子水平，诱导了辅助性T细胞(Th)1/Th2混合免疫应答〔18〕。AP可通过抑制氧化应激水平，提高软骨细胞的活性，改善骨关节炎〔19〕，因此上述研究提示AP对炎症反应及氧化应激具有一定的抑制作用。

本结果表明，在大鼠肢体缺血再灌注后，肝细胞凋亡水平增加，炎症反应及氧化应激水平增加，表现为TUENL染色阳性细胞增多，MPO、TNF-α和IL-1β水平显著升高。当给予AP后，大鼠肝细胞凋亡水平及炎症反应和氧化应激水平均显著降低，表明AP可通过抑制炎症反应和氧化应激水平对肢体缺血再灌注后的大鼠肝损伤具有一定的保护效应。AP的肝脏保护作用目前已有研究证实，有研究发现AP可降低过量对乙酰氨基酚诱导的大鼠肝损伤，改善脂质过氧化和氧化应激，并抑制细胞凋亡〔20〕，因此结合本实验结果，提示AP可能是一种有潜力的肝保护剂。

为了进一步研究AP的潜在的肝损伤保护机制，本实验检测了调节氧化应激损伤的关键信号通路HO-1/Nrf2通路及与炎症免疫机制密切相关的TLR4/NF-κB通路的激活水平，发现AP激活Nrf2/HO-1通路，抑制TLR4/NF-κB通路，降低肢体缺血再灌注后的肝损伤。有研究显示AP可显著提高了间充质干细胞的细胞活力，上调细胞周期蛋白D1、碱性磷酸酶(ALP)和骨形态发生蛋白(BMP)-2蛋白水平，促进细胞增殖和成骨细胞分化〔21〕，此外研究发现AP通过环腺苷酸(cAMP)反应元件结合信号通路显著调控凋亡相关因子的表达，调节细胞凋亡〔22〕，那么AP是否通过调控细胞增殖和凋亡减轻肢体缺血再灌注后的肝损伤，将是下一步的研究重点。

综上，AP通过下调TLR4/NF-κB炎症信号通路，促进HO-1/Nrf2通路抑制氧自由基释放及复杂的细胞因子级联风暴，降低炎症反应和氧化应激水平，缓解肢体缺血再灌注后的肝损伤，本研究为临床治疗肢体缺血再灌注后肝损伤提供了一种可能的治疗策略。