王雅洁 王文斌 费年华

(咸宁市中心医院 1老年病科，湖北 咸宁 437000；2甲状腺乳腺外科)

心肌梗死可导致恶性心律失常、心力衰竭，严重者可导致患者猝死〔1〕。研究发现，心肌细胞肥大属于一种渐进且复杂的过程，是心脏前后负荷增加的多种病理性刺激代偿反应，在早期心肌细胞肥大现象对心脏正常功能具有代偿意义，但随着心肌梗死患者疾病进展，心肌细胞肥大是引发恶性心律失常、心力衰竭、猝死的危险因素〔2〕。细胞周期蛋白(cyclin)D1在神经细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞等终末分化细胞中表达，且参与心肌细胞肥大的发生〔3〕。本研究探讨下调cyclinD1对心肌梗死模型大鼠的干预效果及作用机制。

1 材料与方法

1.1材料 研究动物：选取45只SPF级SD健康大鼠，由常州卡文斯实验动物有限公司提供。鼠龄4～10 w，平均(7.1±1.3)w，体重210～260 g，平均(235.6±10.2)g，饲养温度22～25℃，室内湿度35%～40%，饲养室定时进行紫外线照射消毒。统一喂标准饲料，允许自由活动，饲养时间为1 w。本研究获医院伦理委员会批准。主要试剂：Lipofectmine 2000转染试剂盒(北京义翘神州科技有限公司)；RPMI1640培养基(武汉纯度生物科技有限公司)；小G蛋白RhoA激酶(ROCK)1、ROCK2抗体(佰思诺(天津)生物科技有限公司)；cyclinD1抗体(武汉博士德生物有限公司)。

1.2方法

1.2.1cyclinD1基因转染 取大鼠心肌细胞放置于含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中，在恒温为37℃、含5%CO2的培养箱中做培养处理，当培养瓶中细胞融合率达到80%～90%时使用0.25%的胰酶消化，传代。按照Lipofectmine 2000转染试剂盒操作说明书对大鼠心肌细胞进行转染，根据转染物的不同将大鼠心肌细胞分为siRNA-cyclinD1(下调)细胞、siRNA-对照序列细胞。将转染后的大鼠心肌细胞放置于恒温为37℃、含5%CO2的培养箱中进行培养，进行后续实验。

1.2.2建模及分组 将所有大鼠随机分为空白组、上调组、下调组各15只，参照文献〔4〕构建心肌梗死大鼠模型，所有大鼠腹腔注射10% 35 ml的水合氯醛做麻醉处理，使用生物机能实验系统检测大鼠，在气管插管后连接小动物呼吸机，打开大鼠胸腔，使用撑胸器撑开，将心脏充分暴露出，使用8-0无创伤四丝线合针在大鼠肺动脉圆锥与主动脉交界处大约2 mm处穿过并结扎左冠状动脉前降支。建模成功标志：大鼠结扎线以下心肌波动减缩、颜色变苍白且心电图显示ST段明显抬高。10 min后将转染后的大鼠siRNA-VEGF-B(下调)心肌细胞局部注射于下调组大鼠左心室游离壁上、下、左、右4个部位，siRNA-对照序列(上调)心肌细胞局部注射于上调组大鼠左心室游离壁上、下、左、右4个部位，空白组不做任何处理。注射完成后常规胸腔滴注利多卡因以预防大鼠心室颤动、室性心动过速，吸进胸腔积液后将呼吸机断开，常规关闭胸腔，在各组大鼠苏醒后将气管插管拔除，常规喂养，连续3 d注射青霉素预防感染。

1.2.3心功能检测 腹腔2% 40 mg/kg戊巴比妥钠以麻醉大鼠，使用Vivid7 Dimension彩色多普勒超声检测仪测定大鼠心功能指标，使用探头为13 MHz，深度为3.5 cm，速度为200 mm/s，在取得满意的二维图像后，在乳头肌将M型取样线垂直于室间隔和左心室后获得M型心动图，检测左室舒张末压(LVEDP)、左室舒张压(LVDP)、左室收缩压(LVSP)、心率。

1.2.4左心室重量指数检测 最后1次给药后禁食12 h，将大鼠称完体重后处死，取其心脏，去除心外膜脂肪组织、大血管及心房和右心室后，使用生理盐水进行冲洗，待吸干心脏多余水分后，称得左心室重量(LVW)，并计算左心室重量指数=左心室重量/大鼠体重(BW)。

1.2.5心肌酶水平检测 取所有大鼠尾部静脉血3 ml，采用美国Olympus公司AU640 型全自动生化分析仪检测所有大鼠心肌酶水平，包括肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脱氢酶(LDH)、羟丁酸脱氢酶(HBDH)。

1.2.6病理组织学观察 在大鼠心功能、心肌酶测定完成后，选取各组5只大鼠采用断头法处死，立即取大鼠心肌组织，将提取的组织制作标本，使用40 ml/L的多聚甲醛进行固定，常温下使用15%的乙二胺四乙酸(EDTA)脱钙，脱水后进行石蜡包埋，制作3 μm的组织切片，做苏木素-伊红(HE)染色处理后使用显微镜观察心肌组织病理变化。

1.2.7心肌细胞肥大情况检测 选取各组中5只大鼠，参照Nozato〔5〕所用方法测定各组100个心肌细胞表面积，取9～10个视野，取均值。

1.2.8心肌组织中ROCK/cyclinD1信号通路蛋白表达量检测 Western印迹检测心肌组织中ROCK/cyclinD1信号通路蛋白表达量，提取各组中剩余5只大鼠心肌组织样本，提取样品总蛋白，使用二喹啉甲酸(BCA)法定量分析，50 μg蛋白样品上样后行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，之后转至聚偏氟乙烯膜，避光封闭1 h洗涤，将1∶1 000比例稀释的ROCK1、ROCK2、cyclinD1一抗稀释溶液，4℃下过夜，洗涤，将1∶5 000比例稀释的ROCK1、ROCK2、cyclinD1二抗稀释溶液加入，温床孵育1 h后洗涤，发光液ECL加入，曝光3次，取重叠值，分析蛋白条带灰度值，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参蛋白。

1.3统计学处理 采用SPSS19.0软件行F、t检验。

2 结 果

2.1病理组织学观察 对照组心肌细胞坏死、变性，局部心肌纤维排列紊乱，存在炎性细胞浸润；上调组可见局部心肌细胞坏死，细胞核固缩、碎裂，部分心肌纤维断裂、溶解，大量炎性细胞浸润；下调组可见心肌组织形态清晰，少量心肌细胞坏死，心肌纤维排列较为整齐，少量炎性细胞浸润。见图1。

图1 3组心肌组织(HE，×100)

2.23组心功能比较 上调组LVDP、LVSP水平显著低于空白组，LEVDP、心率显著高于空白组(P<0.05)；下调组LVDP、LVSP水平显著高于空白组，LEVDP、心率显著低于空白组(P<0.05)。下调组LVDP、LVSP水平显著高于上调组、LEVDP、心率显著低于上调组(P<0.05)。见表1。

表1 3组心功能及心肌酶水平比较

2.33组心肌酶水平比较 上调组CK-MB、CK、HBDH、LDH水平均显著高于空白组(P<0.05)；下调组CK-MB、CK、HBDH、LDH水平均显著低于空白组(P<0.05)；下调组CK-MB、CK、HBDH、LDH水平均显著低于上调组(P<0.05)。见表1。

2.43组心肌细胞肥大比较 上调组LVW/BW、心肌细胞横断面积均显著高于空白组(P<0.05)；下调组LVW/BW、心肌细胞横断面积均显著低于空白组(P<0.05)；下调组LVW/BW、心肌细胞横断面积均显著低于上调组(P<0.05)。见表2。

2.53组心肌组织中ROCK/cyclinD1信号通路蛋白表达量比较 上调组心肌组织中ROCK1、ROCK2、cyclinD1蛋白表达量均显著高于空白组(P<0.05)；下调组心肌组织中ROCK1、ROCK2、cyclinD1蛋白表达量均显著低于空白组(P<0.05)；下调组心肌组织中ROCK1、ROCK2、cyclinD1蛋白表达量均显著低于上调组(P<0.05)。见表2、图2。

表2 3组心肌细胞肥大情况及ROCK/cyclinD1信号通路蛋白表达量比较

图2 ROCK/cyclinD1信号通路蛋白

3 讨 论

心肌梗死的发生多以冠状动脉粥样硬化狭窄为基础，在过劳、激动、暴饮暴食、寒冷刺激、大量饮酒等因素的诱导下增加心肌耗氧量或导致冠状动脉痉挛，最终引发急性心肌梗死的发生〔6,7〕。流行病学调查显示，心肌梗死好发于老年人群，致死率较高，且45岁以下人群的发病率呈逐年升高趋势〔8〕。

cyclinD1基因定位于人染色体11q13，包括4个内含子和5个外显子，长度大约为15 kD，编码相对分子质量为34 000的蛋白质〔9,10〕。研究发现cyclin D1基因属于一种较为重要的可调节细胞周期基因，可与周期蛋白依赖性激酶(CDK)4发生结合作用并激活其激酶活性，促使pRb磷酸化，释放E2F，进而诱导细胞从G1期进入至S期，最终促进细胞增殖〔11,12〕。在机体处于正常情况下，细胞进入S期后cyclinD1基因会迅速分解，进而维持细胞正常的增殖过程，但当机体处于病理状态下，cyclinD1基因分解异常，进而导致细胞异常增殖〔13,14〕。李敬美等〔15〕研究发现，细胞周期调节因子cyclinB、cyclinD、cyclinE与H9c2心肌细胞肥大相关。本研究结果说明，下调cyclinD1基因可抑制心肌梗死大鼠心肌细胞肥大，改善心功能，抑制疾病进展。

研究发现心肌梗死发生后会出现心肌细胞肥大现象，属于多种心血管疾病的并发症，心肌细胞肥大可在一定程度上增加恶性心律失常、心力衰竭等不良事件发生率〔16〕。ROCK属于小G蛋白家族成员之一，研究已经证实小G蛋白超家族与心肌细胞肥大相关〔17〕。研究发现小G蛋白家族包括Ras、Rho、Rab、Ran、ARFs五个亚族，其中Ras、Rho与心脏相关〔18〕。RhoA属于Rho亚家族成员之一，RhoA/ROCK参与心肌细胞肥大过程，其经降低内皮型一氧化氮合酶(eNOS)表达或减少eNOS磷酸化，抑制一氧化氮(NO)生成，进而抑制心肌细胞肥大〔19〕。研究显示RhoA/ROCK经激活ERK1/2-GATA信号通路促进心肌细胞肥大〔20〕。而cyclinD1属于细胞周期调控基因，在心肌梗死发生后表达升高，可进一步促进心肌细胞肥大。本研究结果提示下调cyclinD1可能经作用于ROCK/cyclinD1信号通路抑制心肌细胞肥大，最终起到改善心功能的目的。