单海军 娄元俊 朱珊 介小素 侯玉晋 张英英 史华 雷震 曹彩红

(河南省中医院(河南中医药大学第二附属医院)，河南 郑州 450002)

脑瘫是指由于各种因素导致脑部非进行性损伤，其中痉挛型脑瘫(SCP)占脑瘫总发病例数的60%～70%〔1〕。SCP多以四肢运动障碍及姿势异常为主要表现，死亡率、致残率高〔2〕。目前国内外仍无治疗SCP的特效药物，主要以长期康复训练为主〔3〕。SCP中医治疗以补肾、开窍、祛痰为主，通过经络传导将脏腑调理与脑部康复相连，发挥治疗作用〔4〕。补肾开窍祛痰方具有益气活血、补肝益肾、调和阴阳的功效，可通过调理脏腑功能促进脑病康复〔5〕。但补肾开窍祛痰方是否能改善SCP的运动行为学状态及其可能的作用机制尚不明确，仍需深入探讨。鉴于此，本研究通过观察补肾开窍祛痰方对缺氧缺血后SCP大鼠运动行为的改善效果，初步探讨其调控机制。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 SPF级Wistar大鼠，56只，4周龄，雌雄各半，体重110～180 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号SCXK(京)2017-0001。

1.1.2药物、主要试剂和仪器 补肾开窍祛痰方中药材(中国药材公司北京市公司)，丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD，南京建成生物工程研究所，生产批号20180106、20180906)，逆转录试剂盒(大连TaKaRa公司，生产批号AJ60783A)，二喹啉甲酸蛋白定量分析试剂盒(美国热电公司，生产批号180918)，兔抗大鼠脑源性神经营养因子(BDNF)、B细胞淋巴瘤-2基因(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax，美国Abcam公司，生产批号GR5099-42、GR3239757-12、GR3275117-3)。CY-12C便携式测氧仪(杭州艾普设备仪器有限公司)，BI-2000型医学图像分析系统(成都泰盟科技有限公司)，Finesse325型石蜡切片机(英国 Thermo Shando 公司)，BH-2型光学显微镜(日本Olympus公司)，CCD/CMOS型图像采集(日本尼康显微照像系统)，A1300型活体肌张力检测系统(加拿大Aurora公司)，3550UV型酶标仪、7500型实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)仪、i12型电泳仪、CheniDoc XRS型化学发光成像分析系统(美国Bio-rad公司)。

1.2方法

1.2.1模型建立及分组 选取56只Wistar大鼠，其中46只采用双侧颈总动脉结扎法建立SCP大鼠模型〔6〕：采用腹腔注射4%水合氯醛麻醉后，大鼠仰卧位固定，颈部备皮，做颈正中切口，沿气管两侧分离双侧颈总动脉，穿线备用，提起穿线，用微动脉夹夹闭双侧颈总动脉，夹闭20 min后取下微动脉夹再灌注10 min，然后重新夹闭再灌注2次，最后抽去穿线，缝合切口，腹腔注射青霉素钠抗感染。改良Tarlov分级出现3级及以下瘫痪、Ashworth痉挛量表评估肌张力达到1级及以上则判定为SCP大鼠模型建立成功〔7〕，将建模成功大鼠按照随机数字表法分为模型组、低、中、高剂量组；其余10只大鼠仅在双侧颈总动脉穿线，不做夹闭再灌注处理，其余操作同前，将其设为正常组。

1.2.2术后干预 补肾开窍祛痰方组方：醋龟甲10 g、鹿角胶10 g、熟地黄20 g、紫河车3 g、菟丝子10 g、益智仁30 g、石菖蒲6 g、制远志6 g、全蝎3 g、五味子12 g、黄芪12 g，以上中药按《中药学》煎煮标准制作，最终水制剂中每毫升相当于生药1.85 g，人临床用药方法为：每剂分2次分别煎煮至150 ml混匀，早晚分服，300 ml中药汤汁约含生药9.6 g。按照体重换算方法：大鼠临床等效剂量为9.6/60×6.25=1.0 g/kg，低、中、高剂量组用药剂量分别为大鼠临床等效剂量的0.5倍、1.0倍、2.0倍。术后第2天开始分别按生药0.5、1.0、2.0 g/kg体重灌胃给药，正常组、模型组同时灌胃生理盐水3 ml/只，1次/d，持续灌胃28 d。

1.2.3行为学评估 末次灌胃后，进行运动行为学检查及评分〔8〕，斜坡试验：将大鼠头部朝下置于倾斜角为45°的斜坡上，记录旋转至头部向上转过135°的时间；平衡木试验：将80×2.5 cm平衡木悬放于距台面10 cm处，记录大鼠爬行过程中后肢从平衡木上滑脱的次数；旷野试验：将大鼠放于60×60×60 cm不透光木箱中，底部被均分为9个方格，摄像机记录第1 min内穿越方格数(身体穿越1方格一半以上为1格)。

1.2.4脑白质内MDA、SOD水平检测 末次灌胃后，10%水合氯醛麻醉大鼠，即刻开胸腔无菌生理盐水灌注心脏至无血液排除，冰冻手术台迅速取脑组织，嗅球端取脑室周围白质(胼胝体、深层脑白质和部分外囊)，称重后按照1∶9加入预冷生理盐水，制作组织匀浆液，3 500 r/min离心10 min后取上清液，检测脑白质内MDA、SOD含量。

1.2.5脑白质内Bcl-2、Bax、BDNF mRNA相对表达量检测 取大鼠脑白质约75 mg，剪碎后，采用Trizol法提取总核糖核酸(RNA)。用Takara逆转录试剂盒将获得互补链脱氧核糖核酸(cDNA)，并经琼脂糖凝胶电泳鉴定，严格按照PCR试剂盒说明书设定反应体系25 μl：SYBR Premix Ex Taq 11.5 μl，5 μmol/L上下游引物各1 μl，cDNA 1 μl，ddH2O 10.5 μl；反应条件：95℃预变性1 min；94℃变性15 s，60℃退火45 s，72℃延伸45 s，重复35个循环。以β-actin为管家基因，2-△△Ct为目的基因的相对表达强度。Bcl-2：上游：5′-CGTAGCTGATCGTACGTGATCGT-3′，下游：5′-GTAGCTAGCTAGCTAG CTAG CTC-3′；Bax：上游：5′-ATGCTGTATCGTGTAGCTACTGA-3′，下游：5′-GTAGCTGATCGTACGTGCTATCG-3′；BDNF：上游：5′-GTACGTATCGTACGTAGCTC GTC-3′，下游：5′-GTCATCGTAGCTAGCTGCTATCT-3′；β-actin：上游：5′-GTACGTAGCTAGCT AGCTGATCG-3′，下游：5′-CGTAGTCGTACGTAGCTGCTTAA-3′。

1.2.6脑白质内Bcl-2、Bax、BDNF蛋白相对表达量检测 取大鼠脑白质约75 mg，液氮中研磨后转至离心管，加入细胞裂解液，置于100℃水浴中10 min，12 000 r/min离心10 min后取上清液，二喹啉甲酸法进行蛋白定量。取50 μg样品加入等体积上样缓冲液混匀后，100℃水浴加热3 min，再次离心取上清液，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离，电转仪转膜45 min，加入封闭液摇床室温孵育2 h，加入封闭液稀释一抗(1∶1 000)，4℃摇床孵育过夜，洗涤后加入封闭液稀释二抗(1∶10 000)，常温孵育60 min，暗室中显影。应用凝胶成像系统扫描并用灰度值软件分析，以Bcl-2、Bax、BDNF与内参β-actin灰度值比值表示蛋白相对表达量。

1.3统计学分析 采用SPSS20.0软件进行LSD-t检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1大鼠一般情况观察 正常组10只全部存活，其余46只建模期间死亡5只，均发生在术后24 h内，1只建模失败剔除，建模成功率86.96%，大鼠术后均出现精神萎靡、活动减少、反应迟钝、采食量下降；正常组术后12 h开始精神及四肢逐渐恢复，反应正常、采食量逐渐正常。

2.2运动行为学对比 模型组与正常组相比斜坡试验时间较长、平衡木试验后肢滑脱次数较多、旷野试验第1分钟穿过方格数较少，差异均有统计学意义(P<0.05)；3个剂量组与模型组相比，斜坡试验时间较短、平衡木试验后肢滑脱次数较少、旷野试验第1分钟穿过方格数较多，差异均有统计学意义(P<0.05)；3个剂量组作用呈剂量依赖性(P<0.05)。见表1。

2.3脑白质内MDA、SOD水平对比 模型组与正常组相比，脑白质内MDA水平较高、SOD水平较低，差异有统计学意义(P<0.05)；3个剂量组与模型组相比，脑白质内MDA水平较低、SOD水平较高，差异有统计学意义(P<0.05)；3个剂量组作用呈剂量依赖性(P<0.05)。见表1。

表1 运动行为学及脑白质内MDA、SOD水平比较

2.4脑白质内Bcl-2、Bax、BDNF mRNA相对表达量对比 模型组与正常组相比，脑白质内Bcl-2 mRNA相对表达量较低、Bax mRNA相对表达量较高，差异有统计学意义(P<0.05)；3个剂量组与模型组相比，Bcl-2 mRNA相对表达量较高，Bax、BDNF mRNA相对表达量较低，差异有统计学意义(P<0.05)；3个剂量组作用呈剂量依赖性(P<0.05)。见表2。

2.5脑白质内Bcl-2、Bax、BDNF蛋白相对表达量对比 模型组与正常组相比，脑白质内Bcl-2蛋白相对表达量较低，Bax、BDNF蛋白相对表达量较高，差异有统计学意义(P<0.05)；3个剂量组与模型组相比，Bcl-2蛋白相对表达量较高、Bax、BDNF蛋白相对表达量较低，差异有统计学意义(P<0.05)；3个剂量组作用呈剂量依赖性(P<0.05)。见表2、图1。

表2 脑白质内Bcl-2、Bax、BDNF mRNA及蛋白表达量对比

图1 Western印迹检测蛋白表达

3 讨 论

SCP的发病机制较为复杂，由于多种因素如围生期缺血缺氧引起中枢神经系统损伤，进而造成高位中枢对脊髓牵张反射的调控异常，影响运动行为〔9〕。脑部缺血缺氧可引起循环血量下降、能量代谢及钙平衡紊乱等原发性脑组织损伤，且缺血后再灌注可引起继发性损伤，加重脑组织尤其是脑白质的损伤〔10〕。中医理论认为，头部经络密集为诸阳之会，经络可通过表里相配关系将之与脏腑、五官相连，因此可通过调理脏腑、疏通经络而达到治疗脑部疾病的效果〔11〕。

本研究结果提示补肾开窍祛痰方可显著改善缺氧缺血后SCP大鼠运动行为，且其作用呈剂量依赖性。本研究采用双侧颈动总动脉结扎法建立SCP模型，与既往王震〔12〕的报道相符，提示本研究造模大鼠具备SCP上运动神经元病理损伤特点，满足实验要求。补肾开窍祛痰方由醋龟甲、黄芪、熟地黄、紫河车、石菖蒲等11味中药组成，是由孔圣枕中丹加减而成。方中黄芪、熟地黄为均君药，归肝肾经，黄芪益气升阳，熟地黄益精填髓；石菖蒲、紫河车、益智仁、五味子为臣药，归心脾胃经，石菖蒲祛痰开窍、化湿温胃，紫河车益气养血、滋补肾精，益智仁温脾和胃、固精补肾，五味子益气生津、补肾凝心；醋龟甲、鹿角胶、菟丝子、全蝎为佐使药，归肝肾心经，醋龟甲滋阴潜阳，鹿角胶益肾健骨，菟丝子滋阴补肾，全蝎通络止痉〔13〕。诸味中药合用，相辅相成，共奏益气活血、补肝益肾、调和阴阳、祛毒化浊之功效。补肾开窍祛痰方应用于缺氧缺血后SCP之治疗，充分体现治病求本、阴阳相济、益气与补肾并重的配伍技巧，君臣佐使相互配合，可直达病所，改善运动行为事半功倍。

本研究结果提示补肾开窍祛痰方对缺氧缺血后SCP大鼠脑白质损伤的减轻作用可能与上调Bcl-2 mRNA和蛋白表达、下调Bax、BDNF mRNA和蛋白表达、调节Bcl-2/Bax信号通路有关，且其作用在一定范围内呈剂量依赖性。本研究结扎双侧颈总动脉进行SCP造模，可造成大鼠脑组织缺氧、缺血，恢复再灌注后，进一步引发脑组织缺血再灌注损伤，激活脑细胞凋亡系统。SOD是机体中重要的抗氧化酶，脑组织缺血缺氧后再灌注可引起氧自由基大量生成，MDA是其主要代谢产物，过量的MDA可加速神经细胞膜结构异常，加重脑组织损伤程度〔14,15〕。现代药理学研究发现〔16〕，黄芪不仅具有改善微循环、增强机体免疫力等多种功效，而且可改善细胞生理代谢，增强抗缺氧能力及清除自由基能力。Bcl-2是典型凋亡抑制基因，而Bax是Bcl-2的抑制因子，可竞争性结合效应分子，发挥促凋亡作用〔17〕。脑白质缺血应激及再灌注应激损伤后，细胞内自由基含量升高，进而激活Bax基因，启动线粒体膜电位途径激活凋亡程序信号，导致细胞过度凋亡而损伤。BDNF是神经营养家族重要成员，在脑组织中分布广泛。研究发现〔18〕，BDNF可通过反馈调节Bcl-2/Bax信号通路，而减少脑神经元细胞凋亡，进而达到改善神经功能的作用，且BNDF可为脑白质内神经元提供营养环境，提高其存活率。研究发现〔19～21〕，致远散可有效缓解东莨菪碱对脑记忆功能的损害；石菖蒲水提取物可有效抑制N-甲基-D-天门冬氨酸受体与相应配体结合，发挥抗惊厥、抑制神经元细胞凋亡作用；熟地黄可有效缩短衰老大鼠Morris水迷宫平台潜伏期，增强其学习记忆功能。本研究应用不同剂量补肾开窍祛痰方对缺氧缺血后SCP大鼠干预后，一方面增强细胞抗缺氧及清除氧自由基能力，改善脑组织微循环系统，另一方面通过抑制Bcl-2/Bax凋亡信号通路、上调BNDF mRNA和蛋白的表达，减轻缺氧缺血脑白质损伤，改善大鼠运动能力。