尤华琴 张延英 吴俊晓 刘前

(1南阳医学高等专科学校，河南 南阳 473000；2南阳医学高等专科学校第一附属医院神经内科)

癫痫病是世界上最严重的神经系统疾病之一，其特征在于无故癫痫的反复发作〔1〕。尽管离子通道或神经递质系统疗法可有效缓解癫痫患者发作症状，但对约40%患者无效，甚至可能加重认知障碍等并发症〔2,3〕。因此，明确药物的作用机制对改善癫痫临床治疗至关重要。吡仑帕奈(PER)是于2012年上市的第三代抗癫痫药物，主要通过作用于α-氨基羟甲基恶唑丙酸(AMPA)受体发挥抗癫痫作用，但其具体作用途径尚未完善〔4〕。研究证实，活化细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)/cAMP反应元件结合蛋白(CREB)/脑源性神经营养因子(BDNF)信号通路与癫痫大鼠发作次数减少及记忆障碍恢复密切相关〔5〕，但PER对癫痫的治疗作用是否与ERK/CREB/BDNF途径相关尚不清楚。本研究通过戊四氮(PTZ)诱导制备大鼠癫痫模型，研究PER在癫痫治疗过程中对ERK/CREB/BDNF相关蛋白的影响。

1 材料与方法

1.1实验动物 清洁级雄性Wistar大鼠62只，6周龄，体重(200±20)g，购自上海西普尔必凯实验动物有限公司，动物生产许可证号：SCXK(沪)2018-0036，动物使用许可证号：SYXK(沪)2018-0049，动物质量合格证号：XP202030674。本研究经南阳医学高等专科学校动物伦理委员会批准，并遵守3R保护原则进行实验。实验前动物均在安静、清洁的实验环境下饲养1 w，给予适宜的温度(23～25℃)和24 h光照/暗周期，允许自由饮食。

1.2主要药品与试剂 PER(批号：H20190054，规格2 mg/片)购自卫材(中国)药业有限公司；PTZ(批号：P6500)购自美国Sigma公司；大鼠肿瘤坏死因子(TNF)-α酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(批号：SEKR-0009)、白细胞介素(IL)-10 ELISA试剂盒(批号：SEKR-0006)、丙二醛(MDA)含量检测试剂盒(批号：BC0025)、超氧化物歧化酶(SOD)活性检测试剂盒(批号：BC0170)、尼氏染色液(批号：G1432)均购自北京Solarbio公司；蛋白抽提试剂盒(批号：G7011)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒(批号：G7134)均购自上海信帆生物科技有限公司；ERK小鼠抗大鼠单克隆抗体(批号：13-6200)、磷酸化(p)-ERK小鼠抗大鼠单克隆抗体(批号：13-6258)、CREB小鼠抗大鼠单克隆抗体(批号：MA1-083)、p-CREB小鼠抗大鼠单克隆抗体(批号：MA5-11192)、BDNF兔抗大鼠单克隆抗体(批号：PA-95183)和β-肌动蛋白(β-actin)兔抗大鼠单克隆抗体(批号：PA1-183)、山羊抗鼠二抗(批号：A32731)均购自美国Thermo Fisher Scientific公司。

1.3主要仪器 离心机(型号：FG-NG003)购自北京佰司特贸易有限责任公司；生物显微镜(型号：CX41)购自日本Olympus公司；酶标仪(型号：PR4100)和凝胶成像仪(型号：VersaDoc 3000)均购自美国Bio-Rad公司。

1.4动物模型制备及分组 将大鼠编号，采取随机数表法分为对照组(n=12)和实验组(n=50)，其中实验组均给予腹腔注射30 mg/kg PTZ，注射后观察1 h左右，连续注射4 w。大鼠出现3次以上双侧前肢抽搐，并伴有身体直立等症状，则建模成功〔6〕，其中建模过程中有2只大鼠未出现以上症状，建模失败，成功建模48只大鼠。将建模成功的大鼠随机分为：模型组、PER低、中、高剂量组，每组12只。然后各组按照以下方式处理10 w：对照组和模型组给予生理盐水灌胃处理，PER低剂量组、PER中剂量组和PER高剂量组分别给予0.3、1.0和3.0 mg/kg〔7〕PER灌胃处理，给药体积均为10 ml/kg，1次/d。

1.5癫痫发作评估〔8〕PER灌胃处理10 w后，根据Racine分级标准评估观察每只大鼠癫痫发作1 h的强度。Racine分级标准：0级：无任何反应；1级：多动和抽搐；2级：肌阵孪性抽搐或点头；3级：前肢阵孪；4级：站立在其后腿上；5级：阵孪性癫痫发作且无反射。另外，观察1 h内癫痫发作频率和每次癫痫持续时间。

1.6莫里斯水迷宫(MWM)实验〔9〕定位航行实验：将各组大鼠在迷宫水箱中连续训练5 d，每次进行4组平行实验，间隔120 s。第1天让大鼠自由游泳1 min后开始实验，其余4 d在同时段进行实验，但随机选择入水点，并将大鼠面壁放入池水中，记录大鼠从入水至寻找并爬上平台花费的时间，即为逃避潜伏期(s)，如在120 s内未完成，则将潜伏期计为120 s。空间探索试验：在第6天撤走平台后，随机选择入水点将大鼠面壁放入池水中，测量大鼠在120 s内穿越原平台位置的次数及在目标象限停留时间。

1.7大脑皮层组织匀浆的制备 在MWM实验结束2 h后，处死大鼠，取大脑皮层组织，生理盐水洗涤后均分成两半。立即用含三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl，50 mmol/L，pH7.4)和蔗糖(300 mmol/L)的溶液对一半大鼠大脑皮层组织充分匀浆，离心(10 000 r/min，10 min)，分离上清，分装后，-80℃备用。

1.8氧化应激指标检测 取1.7保存的大脑皮层组织匀浆上清液，按照试剂盒说明书步骤，检测MDA、TNF-α、IL-10水平和SOD活性。

1.9尼氏染色实验 取1.7中另一半大鼠大脑皮层组织，在3%甲醛溶液固定24 h，酒精脱水，石蜡包埋，切片(5 μm/片)，置于载玻片，用甲基紫染色液涂片，染色10～20 min，二甲苯中冲洗，封片后，于显微镜下观察。

1.10Western印迹分析实验 蛋白抽提试剂盒提取1.7中大脑皮层组织匀浆上清液总蛋白，然后采用BCA法检测蛋白含量，经12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜、封闭2 h，TBST洗3次，依次加入一抗ERK、p-ERK、CREB、p-CREB、BDNF和β-actin(稀释比均为1∶1 000)，4℃过夜，加入二抗(1∶5 000)孵育2 h，化学发光液(ECL)曝光显影，利用Image-J软件分析目标蛋白条带灰度相对值。

1.11统计学方法 采用SPSS25.0软件进行方差分析，SNK-q检验。

2 结 果

2.1PER对癫痫大鼠发作行为的影响 与对照组相比，模型组癫痫发作频率、癫痫持续时间和Racine分级显著增加(P<0.05)；与模型组相比，PER低剂量组、PER中剂量组和PER高剂量组癫痫发作频率、癫痫持续时间和Racine分级依次明显降低(P<0.05)。见表1。

表1 各组癫痫发作行为比较

2.2PER对癫痫大鼠认知功能的影响

2.2.1训练期间大鼠逃避潜伏期变化 与对照组相比，第1、2、3、4和5天模型组大鼠逃避潜伏期显著增加(P<0.05)；与模型组相比，第1、2、3、4和5天PER低、中、高剂量组大鼠逃避潜伏期依次明显降低(P<0.05)；与第1天相比，各组逃避潜伏期随训练时间的延长呈逐渐缩短趋势。见表2。

2.2.2训练后的空间记忆能力变化 与对照组相比，模型组大鼠穿越原平台位置的次数显著降低(P<0.05)，目标象限停留时间显著增加(P<0.05)；与模型组相比，PER低、中、高剂量组大鼠穿越原平台位置的次数依次增加(P<0.05)，目标象限停留时间依次降低(P<0.05)。见表2。

2.3PER对癫痫大鼠大脑皮层神经元细胞形态的影响 对照组尼氏小体丰富且分布均匀，大脑皮层神经元排列整齐；模型组大脑皮层神经元胞质染色不足，神经元细胞排列紊乱；经PER治疗后，各组大脑皮层组织神经元形态得以恢复。见图1。

表2 各组逃避潜伏期、空间探索试验结果比较

图1 各组大脑皮层组织神经元细胞形态(尼氏染色，×400)

2.4PER对癫痫大鼠大脑皮层组织p-ERK/ERK、p-CREB/CREB和BDNF蛋白表达的影响 与对照组相比，模型组大脑皮层组织p-ERK/ERK、p-CREB/CREB和BDNF蛋白表达显著降低(P<0.05)；与模型组相比，PER低剂量组、中、高剂量组大脑皮层组织p-ERK/ERK、p-CREB/CREB和BDNF蛋白表达依次明显升高(P<0.05)。见图2、表3。

2.5PER对癫痫大鼠大脑皮层组织MDA、TNF-α、IL-10水平和SOD活性的影响 与对照组相比，模型组大脑皮层组织MDA和TNF-α水平显著升高(P<0.05)，IL-10水平和SOD活性显著降低(P<0.05)；与模型组相比，PER低、中和高剂量组大脑皮层组织MDA和TNF-α水平依次显著降低(P<0.05)，IL-10水平和SOD活性依次明显升高(P<0.05)。见表3。

1～5：对照组，模型组，PER低剂量组，PER中剂量组，PER高剂量组图2 各组大脑皮层组织ERK、CREB和BDNF蛋白表达

表3 各组大脑皮层组织MDA、TNF-α、IL-10水平、SOD活性、ERK、CREB和BDNF蛋白表达量比较

3 讨 论

癫痫病在全球范围内影响超过5 000万人，且死亡率呈逐年增加趋势〔10〕。此外，癫痫可表现为原发性脑肿瘤、转移性疾病、血管或手术并发症、机会性感染或继发于抗肿瘤治疗〔11〕。认识功能障碍是癫痫最严重并发症之一，在患者治疗管理中具有重要作用〔12〕。研究发现，临床治疗对患者认知功能定时监测，可有效减少认知功能损害和不良预后〔13〕。因此，提升癫痫患者认知功能是改善当前药物药效的最有效途径。PTZ诱导动物癫痫发作，是筛选并研究抗癫痫药及其作用机制常见的大鼠癫痫模型〔14〕。

PER是以AMPA受体为靶点、具有高度选择性的抗癫痫药物，可用于原发性全面强直阵孪癫痫的治疗〔15,16〕。本研究发现，PER治疗后能够减少大鼠癫痫发作频率、癫痫持续时间和Racine分级，初步验证了PER对癫痫的治疗作用。本研究结果提示PER治疗能够改善PTZ诱发的癫痫大鼠认知功能障碍。癫痫大鼠大脑皮层组织神经元形态发生异常。Mohseni-Moghaddam等〔17〕研究证实，抑制癫痫大鼠氧化应激和炎症反应，可能与减轻认知功能障碍的神经元损伤相关。本研究结果提示PER可能通过降低氧化应激和炎症反应，对癫痫大鼠神经元产生保护作用，从而达到控制癫痫发作的疗效。

神经元突触的完整性是保障认知功能正常的关键，其中BDNF是调节突触形成的中重要因素〔18〕。CREB是一种参与调节BDNF转录的因子，其激活依赖于ERK通路，并与认知过程密切相关〔19〕。本研究结果表明癫痫导致ERK/CREB/BDNF途径激活受阻。在精神分裂症大鼠中，加强CREB/BDNF/酪氨酸激酶受体(Trk)B途径，能够促进ERK磷酸化水平，预防大鼠认知障碍〔20〕；Liao等〔21〕和Ko等〔22〕证实，激活ERK/CREB信号通路，可以提高海马组织中BDNF水平，对胆碱阻滞导致的大鼠或小鼠学习和记忆障碍具有治疗作用。本研究提示PER可能通过激活ERK/CREB/BDNF途径，改善癫痫大鼠的认知障碍。