杨文红 丁红炜 王魏 王林娜 郭玲

(1衡水市人民医院皮肤科，河北 衡水 053000；2山东大学第二医院整形外科；3衡水市人民医院病理科)

皮肤基底细胞癌(BCC)是皮肤病理学中常见的非黑色素皮肤瘤，多发生于老年人，研究报道，BCC的患病率和发病率逐年不断上升，且发病人群趋于年轻化，给患者和医疗系统带来较大负担〔1,2〕。微小RNA(miRNA)是由22个核苷酸组成的单链非编码小分子RNA，与其靶基因结合参与调节基因的转录和翻译，与细胞发育、分化、迁移等多种生物学过程相关，miRNA的异常表达与免疫应答、神经性疾病、癌症等多种疾病的发生发展密切相关〔3～5〕。研究发现，miR-451在非小细胞肺癌中异常表达，是一种新型肿瘤抑制因子〔6〕。T结构域转录因子(TBX)1是一种转录因子，在组织发育中起重要作用，研究显示，miR-451可靶向作用于TBX1在BCC发生中起关键作用〔7〕，但关于miR-451、TBX1在BCC预后中作用的报道较少。本研究通过检测miR-451、TBX1在BCC组织中的表达，探讨其与预后的相关性，以期为BCC的临床诊治提供一定理论依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2013年8月至2018年3月于衡水市人民医院皮肤科经手术治疗的老年BCC患者85例，其中男44例，女41例，平均年龄(67.85±5.62)岁，根据其临床表现分为：结节溃疡型组38例，色素型组27例，浅表型组15例，硬斑病样或纤维化型组5例，各组年龄、性别、体重指数(BMI)比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组一般资料比较

纳入标准：(1)患者年龄≥60岁；(2)组织病理学活检确诊为BCC；(3)患者的病理资料及随访资料完整；(4)无化学治疗史。排除标准：(1)患有免疫系统疾病患者；(2)患有认知障碍和沟通障碍患者；(3)肝、肾功能不全患者。本研究获得衡水市人民医院伦理委员会审查批准，且受试者均签订知情同意书。

1.2主要试剂及仪器 Trizol提取试剂盒(批号：RN0401)购自北京艾德莱生物科技公司；逆转录试剂盒(批号：K1622)购自美国Fermentas公司；AceQ qPCR SYBR Green Master Mix实时荧光定量PCR试剂盒(批号：Q111-02)购自南京诺唯赞生物科技有限公司；TBX1抗体(批号：PAB17338)购自艾美捷科技有限公司；鼠抗人二抗(批号：054920)购自美国Invitrogen公司；实时荧光定量PCR仪(型号：CFX384Touch)购自美国伯乐公司；光学显微镜(型号：DM2700)购自德国徕卡公司。实时荧光定量PCR(RT-qPCR)所需引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3方法

1.3.1RT-qPCR检测BCC患者组织标本中miR-451、TBX1 mRNA表达 收集患者手术切取活体组织标本，用Trizol法提取组织总RNA，反转录为cDNA，用RT-qPCR检测BCC患者组织标本中miR-451、TBX1 mRNA表达。miR-451上游引物：5′-AAAAAAACCGTTACCGA-3′，下游引物：5′-GTTACCATTACTGAGTT-3′；TBX1上游引物：5′-CTGACCAATAACCTGCTGGATGA-3′，下游引物：5′-GGCTGATATCTGTGCATGGAGTT-3′；U6上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACAGAC-3′，下游引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；GAPDH上游引物：5′-GGAGTCCACTGGCGTCTTCA-3′，下游引物：5′-GGGGTGCTAAGCAGTTGGTG-3′。配制20 μl反应体系，反应条件：预变性95℃ 30 s；变性95℃ 5 s，退火60℃ 30 s，延伸70℃ 10 s，共35个循环。以U6、GAPDH为内参，用2-ΔΔCt计算miR-451、TBX1 mRNA相对表达量。

1.3.2免疫组化检测TBX1在BCC组织中表达 将患者手术切取活体组织，用10%甲醛固定做常规石蜡切片，然后进行脱蜡水化、水浴加热修复抗原、孵育一抗(TBX1抗体，1∶500)，4℃过夜，次日，滴加二抗，室温孵育1 h，二氨基联苯胺(DAB)染色、水洗、苏木素复染、脱水、透明、中性树胶封片，用磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作为阴性对照。

1.3.3免疫组化结果判定 TBX1免疫组化结果判定：细胞核中出现黄色或棕黄色则为TBX1阳性，在显微镜下随机选取5个视野，根据Fromowitz方法〔8〕进行评分，阳性细胞所占百分比：<5% 0分，5%～25% 1分，26%～50% 2分，51%～75% 3分，>75% 4分；染色强度：无着色0分，浅黄色1分，黄色2分，棕黄色3分。阳性细胞所占百分比得分与染色强度得分总和：≥2分为阳性，<2分为阴性。

1.3.4随访 患者术后，前3个月每个月复查1次，4～12月每3个月复查1次，1年后主要以电话随访和登门拜访两种随访方式收集患者资料，随访截止时间2020年1月，平均随访(55.85±6.50)个月。

1.4统计学处理 采用SPSS22.0软件进行单因素方差分析、SNK-q检验、χ2检验、Pearson相关分析；绘制Kaplan-Meier生存曲线，并进行Log-rank检验。

2 结 果

2.1各组BCC组织中miR-451、TBX1 mRNA表达水平 与结节溃疡型组相比，色素型组、浅表型组、硬斑病样或纤维化型组组织中miR-451表达水平显著降低(P<0.05)，TBX1 mRNA表达水平显著升高(P<0.05)；与色素型组、浅表型组相比，硬斑病样或纤维化型组miR-451表达水平显著降低(P<0.05)，TBX1 mRNA表达水平显著升高(P<0.05)。见表2。

2.2各组BCC组织中TBX1阳性表达 与结节溃疡型组〔12例(31.58%)〕相比，TBX1阳性表达率在色素型组〔17例(62.96%)〕、浅表型组〔10例(66.67%)〕、硬斑病样或纤维化型组〔4例(80.00%)〕BCC组织中显著增加(P<0.05)。

2.3miR-451、TBX1表达与BCC患者临床病理特征的关系 根据miR-451在BCC组织中表达水平平均值分为高表达组(≥0.91，43例)，低表达组(<0.91，42例)，miR-451、TBX1在BCC组织中的表达与患者年龄、皮损直径无关(P>0.05)，与组织病理分型、转移情况显著相关(P<0.05)。见表3。

表2 各组BCC组织中miR-451表达水平比较

1)与结节溃疡型组相比，2)与硬斑病样或纤维化型组相比:均P<0.05

表3 miR-451、TBX1表达与BCC患者临床病理特征的关系〔n(%)〕

2.4BCC组织中miR-451与TBX1表达的关系 BCC组织中miR-451与TBX1表达呈负相关(r=-0.618，P<0.05)。见图1。

2.5miR-451、TBX1在BCC组织中表达与患者预后的关系 随访期间72例未出现复发或转移，患者无病生存率为84.71%。miR-451低表达患者无病生存率〔80.95%(34/42)〕显著低于miR-451高表达患者〔88.37%(38/43)，P=0.044〕，TBX1阳性表达患者无病生存率〔83.72%(36/43)〕显著低于TBX1阴性表达患者〔85.71%(36/42)，P=0.042〕。见图2。

图1 BCC组织中miR-451与TBX1表达的关系

图2 不同miR-451、TBX1表达BCC患者生存曲线

3 讨 论

BCC多发生在面部、头皮等曝光部位，BCC具有生长缓慢、局部浸润性等特征，因此BCC患者发生转移的较少，但其组织分型较多，根据其表型表现和组织病理学分为低风险型和高风险型，高风险型的BCC具有较强的浸润性和侵略性，在进行手术治疗后引起并发症，即愈合缺陷，植皮失败和伤口感染的风险较高〔9,10〕。研究表明，分子靶向治疗技术在BCC临床治疗中发挥重要作用〔11,12〕，因此，在分子水平研究BCC发病机制，有利于临床治疗BCC新型靶向疗法的发展和预后监测。

miRNA可以调节转录后相关蛋白的表达并调节肿瘤的发展，崔胜金等〔13〕研究显示，miR-451在非小细胞肺癌中低表达，与肿瘤大小、淋巴结转移和TNM分期显著相关，可以作非小细胞肺癌早期诊断的候选标志物。高瑶等〔14〕研究显示miR-451可以减少卵巢癌细胞增殖，是一种可以预测上皮性卵巢癌患者预后不良的独立因素。包佑根等〔15〕研究显示miRNA-451在膀胱癌组织低表达，且其表达水平与膀胱癌临床病理特征及癌细胞转移潜能密切相关，是膀胱癌潜在的调控基因。以上研究均表明，miR-451的异常表达与多种肿瘤疾病发生相关，对其诊断、预后有重要作用。本研究提示miR-451表达异常与BCC的发生发展有关，且其表达水平可能与其病理分型有关，本研究结果提示，miR-451在BCC组织中的表达与患者组织病理分型、转移情况显著相关。

TBX1属于T-BOX家族，可以调节细胞生长或组织发育〔16,17〕，TBX1的异常表达与遗传性疾病、心血管疾病、肿瘤等疾病发生相关〔18～20〕，Verdelli等〔21〕研究显示TBX1在成人甲状旁腺细胞中表达，在甲状旁腺肿瘤中表达失调，其中TBX1缺乏可能会导致甲状旁腺肿瘤的低增殖性。本研究提示TBX1表达与BCC的发生发展密切相关，进一步研究分析发现，TBX1在BCC组织中的表达与患者组织病理分型、转移情况显著相关。Sun等〔7〕研究显示，TBX1在BCC肿瘤组织中显著上调，miR-451a表达水平与TBX1表达水平相反。本研究结果显示，BCC组织中miR-451、TBX1表达呈负相关。徐品等〔22〕研究显示，miR-451可以作为诊断肝癌和指示预后的生物标志物。本研究进一步Kaplan-Meier生存曲线结果提示BCC组织中miR-451、TBX1表达水平可作为预测患者预后的分子标志物。

综上所述，肿瘤组织中miR-451低表达和TBX1高表达与BCC的发生发展及预后密切相关，可能成为BCC临床病理分型及预后评估的辅助指标。但由于样本数量较少，需要扩大样本量进一步验证。