吴松，郝小康，张振华，高晓，杜伟平

（1.三二〇一医院 医学检验科，陕西 汉中 723000；2.西藏民族大学附属医院 检验科，陕西 咸阳 712082；3.三二〇一医院 心胸外科，陕西 汉中 723000；4.陕西省核工业二一五医院 病理科，陕西 咸阳 712000；5.延安大学附属医院 检验科，陕西 延安 716000）

肺癌是全球常见的呼吸系统恶性肿瘤，每年发病患者约180 万例，死亡约159 万例[1]。非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）是肺癌最常见的类型。虽然分子靶向治疗及免疫治疗等改善了NSCLC 患者的生存预后，但5年总体生存率仍较差，仅20%左右[2]。NEDD4 样E3 泛素蛋白连接酶（NEDD4L）的编码基因位于18q21.31，其编码蛋白属于HECT 域E3 泛素连接酶的NEDD4 家族成员，能将E2 泛素结合酶转移到蛋白质底物，从而降解特定蛋白质进行溶酶体[3]。有研究表明，NEDD4L 在肿瘤中发挥抑制肿瘤的功能，通过抑制促癌因子（如缺氧诱导因子1α）的表达，抑制恶性肿瘤的发生、发展，在胃癌及卵巢癌等恶性肿瘤中NEDD4L表达下调，促进肿瘤的恶性进展[4-5]。UNC-51 样激酶1（ULK1）编码基因位于12q24.33，编码蛋白参与ULK1 复合物构成，整合不同磷酸化和泛素化的信号传导，是促进自噬起始的主要因子[6]。有研究表明，肿瘤中ULK1作为一种促癌基因，在乳腺腺癌、胃癌等恶性肿瘤中表达上调，能使磷脂酰肌醇3 激酶复合物磷酸化，促进肿瘤细胞的恶性增殖[7-8]。本研究通过检测NSCLC 癌组织中NEDD4L、ULK1 的表达，初步探讨两者的临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2017年1月—2018年1月三二〇一医院收治的88 例NSCLC 患者作为研究对象。其中男性55例，女性33例；年龄36～79岁，平均（59.2±7.8）岁；病理类型：腺癌60 例，鳞癌28 例；肿瘤直径≤5 cm 52例，＞5 cm 36例；肿瘤TNM分期：Ⅰ、Ⅱ期57 例，Ⅲ期31例。病理分级：高中分化49例，低分化39 例；有淋巴结转移19 例，无淋巴结转移69 例。纳入标准：①经病理组织学检查明确诊断为NSCLC，由2 位病理科医师共同诊断；②初次诊治，无放化疗、靶向治疗史；③临床及随访资料完整；④患者和家属对本研究知情同意，能够配合完成随访。排除标准：①伴肺炎等感染性疾病或类风湿性关节炎等自身免疫系统疾病；②伴其他恶性肿瘤；③心肺器官衰竭，体能状态较差，KPS 评分＜70分。本研究经医院伦理委员会批准通过。

1.2 主要试剂和仪器

兔单克隆NEDD4L 抗体、兔单克隆ULK1 抗体购自美国Abcam 公司，二步法免疫组织化学试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司，显微镜购自日本Olymbus 株式会社。

1.3 方法

将癌组织和癌旁组织放入10%甲醛溶液中固定24 h。石蜡包埋，切片，二甲苯脱蜡2遍，10 min/次，梯度酒精脱水，每个梯度5 min。切片放入柠檬酸缓冲液中微波炉加热至煮沸，维持5 min 抗原热修复。避光室温滴加3%过氧化氢去除内源性过氧化物酶，一抗4℃避光过夜（NEDD4L 稀释比1∶500，ULK1 稀释比1∶400），二抗室温30 min，二氨基联苯胺显色30 s，苏木素核染2 min，盐酸酒精分化5 s，梯度酒精脱水，中性树脂封片。200 倍显微镜下观察阳性表达部位的染色强度和范围，染色评分根据染色强度（0 分为无染色，1 分为染色浅，2 分为染色深）和染色面积（0 分为≤25%，1 分为＞25%～＜50%，2 分为≥50%）的乘积评估。总分＜2 分为阴性表达，≥2 分为阳性表达。应用R 语言分析癌症基因组图谱（TCGA）数据库中NSCLC 及其癌旁组织中NEDD4L 和ULK1 mRNA 的表达差异。患者随访3～36 个月，平均（30.1±4.3）个月。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 22.0 统计软件。正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用t检验，非正态分布的计量资料以中位数和四分位数间距[M（P25，P75）]表示，比较用Mann-WhitneyU检验；计数资料以率（%）表示，比较用χ2检验；相关性分析用Spearman 法；Kaplan-Meier 法绘制生存曲线，比较用log-rank χ2检验；影响因素的分析用单因素或多因素Cox 回归模型。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NSCLC 癌组织与癌旁组织中NEDD4L、ULK1 mRNA相对表达量比较

NSCLC 癌组织与癌旁组织中NEDD4L mRNA 相对表达量分别为4.32 （3.62，5.02）、5.46 （5.14，5.79），ULK1 mRNA 分别为4.63（3.92，5.35），4.27（3.98，4.56），经Mann-WhitneyU检验，差异有统计学意义（Z=8.433 和3.793，均P=0.000），癌组织NEDD4L mRNA 相对表达量低于癌旁组织，ULK1 mRNA 相对表达量高于癌旁组织。见图1。

图1 NSCLC癌组织与癌旁组织NEDD4L、ULK1 mRNA相对表达量比较

2.2 NSCLC癌组织与癌旁组织中NEDD4L、ULK1蛋白表达及阳性表达率比较

NSCLC 癌组织中NEDD4L 阳性表达主要位于细胞浆和细胞膜，ULK1 阳性表达主要位于细胞核（见图2）。癌组织中NEDD4L 的阳性表达率为26.1%（23/88），癌旁组织为73.9%（65/88），经χ2检验，差异有统计学意义（χ2=40.091，P=0.000），癌组织低于癌旁组织。癌组织中ULK1 的阳性表达率为75.0%（66/88），癌旁组织为25.0%（22/88），经χ2检验，差异有统计学意义（χ2=44.000，P=0.000），癌组织高于癌旁组织。

图2 癌组织NEDD4L、ULK1蛋白表达 （×200）

2.3 不同临床特征患者的癌组织中NEDD4L、ULK1阳性表达率比较

有无淋巴结转移、不同TNM 分期患者的癌组织NEDD4L、ULK1 阳性表达率比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。其余指标的NEDD4L、ULK1 阳性表达率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 不同临床特征患者的癌组织中NEDD4L、ULK1阳性表达率比较 例（%）

2.4 NSCLC患者NEDD4L与ULK1表达的相关性

Spearman 相关性分析结果显示，NEDD4L 与ULK1 的表达呈负相关（rs=-0.587，P=0.000）。

2.5 癌组织中NEDD4L和ULK1表达对NSCLC患者生存预后影响

随访期间死亡32 例，3年总体生存率为63.6%（56/88）。NEDD4L 阳性表达患者3年总体生存率为87.0%（20/23），NEDD4L 阴性表达患者为55.4%（36/65），经Log-rank χ2检验，差异有统计学意义（χ2=6.114，P=0.008），NEDD4L 阴性表达患者3年总体生存率较阳性表达患者低。NEDD4L 阳性表达患者平均生存时间为（32.2±5.0）个月，NEDD4L 阴性表达患者为（21.4±4.2）个月，经t检验，差异有统计学意义（t=10.075，P=0.000），NEDD4L 阳性表达患者平均生存时间较阴性表达患者长。见图3。

ULK1 阳性表达患者的3年总体生存率为54.55%（36/66），ULK1 阴性表达患者为90.91%（20/22），经Log-rank χ2检验，差异有统计学意义（χ2=7.814，P=0.002），ULK1 阳性表达患者3年总体生存率较阴性表达患者低。ULK1 阳性表达患者的平均生存时间为（33.4±5.3）个月，ULK1 阴性表达患者为（20.7±4.6）个月，经t检验，差异有统计学意义（t=10.041，P=0.000），ULK1 阳性表达患者平均生存时间较阴性表达患者长。见图3。

图3 NEDD4L和ULK1表达对NSCLC患者生存预后的影响

2.6 单因素及多因素Cox 回归分析影响NSCLC预后的危险因素

将年龄（＜60 岁= 0，≥60 岁= 1）、性别（男= 0，女= 1）、肿瘤直径（≤5 cm= 0，＞5 cm= 1）、病理类型（腺癌= 0，鳞癌=1）、病理分级（高中分化= 0，低分化=1）、TNM 分期（Ⅰ、Ⅱ期= 0，Ⅲ期= 1）、淋巴结转移（无= 0，有= 1）、NEDD4L（阳性= 0，阴性= 1）、ULK1（阴性= 0，阳性= 1）作为自变量，将NSCLC 患者随访过程中的生存状态作为因变量（死亡= 1，存活=0），做单因素及多因素Cox 回归分析。

表3 影响NSCLC患者预后的单因素Cox回归分析参数

多因素Cox 回归分析结果显示，NEDD4L 阴性表达[=1.878（95% CI：0.961，2.995）]、ULK1 阳性表达[=1.679（95% CI：0.785，2.884）]及肿瘤TNM分 期Ⅲ期[=1.937（95% CI：1.131，3.317）] 是NSCLC 患者不良预后的独立危险因素（P＜0.05）。见表4。

表4 影响NSCLC患者预后的多因素Cox回归分析参数

3 讨论

NSCLC 作为肺癌的最常见类型，约占85%[9]，大多数NSCLC 患者初次诊断时癌细胞即发生转移[10-11]。在过去20年里，随着肿瘤生物学和肿瘤进展机制的研究，NSCLC 的治疗取得了重要进展。然而，NSCLC 的总体治愈率和存活率仍然很低。因此，需要研究新的预后判断的肿瘤标志物，以改善NSCLC 的疗效[12]。

NEDD4L 是一种E3 泛素蛋白连接酶，包含1 个HECT 结构域。NEDD4L 的下游靶点多数是膜蛋白，包括离子通道和转运蛋白，NEDD4L 活性对于维持血压和正常生理机能发挥重要的作用[13]。有研究表明，NEDD4L 在肿瘤中发挥抑癌因子的作用，其通过调控肿瘤信号通路的Dvl2 蛋白质的降解，导致Wnt信号通路抑制，抑制肿瘤的侵袭和转移[14]。近年来研究表明，多种肿瘤中存在NEDD4L 表达下调，通过影响肿瘤细胞的线粒体代谢，促进肿瘤的恶性增殖、浸润、转移[15]。本研究中NSCLC 癌组织中NEDD4L 在mRNA 及蛋白表达均明显降低，与WANG等[16]报道结果一致。NEDD4L 表达下调的机制与微小RNA 调控有关。有研究表明，微小RNA-513a-5p能够结合于NEDD4L mRNA 的3’非编码区域，促进NEDD4L mRNA 的降解，抑制NEDD4L 的表达[17]。此外，WANG 等[16]报道Zeste 同源物2（EZH2）介导的多梳组蛋白增强子H3K27 甲基化，能够抑制NEDD4L的表达，敲低EZH2 的表达后NEDD4L 的表达再次升高，进一步证实了EZH2 对NEDD4L 的调控功能。本研究发现，NSCLC 肿瘤分期Ⅲ期、有淋巴结转移的NSCLC 癌 组织中NEDD4L 表达 较低，提示NSCLC 中NEDD4L 的低表达与肿瘤恶性进展有关。分析其原因，NEDD4L 的表达下调可导致下游靶蛋白SMAD2和SMAD7 的积累，SMAD2 和SMAD7 能够导致转化生长因子β（TGF-β）信号通路激活，促进肿瘤细胞的迁移及侵袭，导致肿瘤的进展[18]。此外，JIANG 等[4]发现NEDD4L 能够泛素化降解缺氧诱导因子1A，NEDD4L 表达下调后导致缺氧诱导因子1A 的下游靶点如血管内皮生长因子表达升高，促进肿瘤血管生成，促进肿瘤的恶性发展。

ULK1 是哺乳动物中ATG1 基因的同源物，能与自噬蛋白如FIP200 等形成蛋白质复合物，调节自噬的启动，是自噬过程中重要的细胞质激酶[19]。研究表明，ULK1在人类乳腺癌及胃癌等多种肿瘤中表达上调，作为重要的致癌基因，能够在营养缺乏的环境中通过蛋白质-蛋白质相互作用诱导自噬发生，并促进肿瘤的增殖[7-8]。因此，ULK1 是肿瘤中一种具有潜力的重要的诊断治疗靶点。本研究中，NSCLC 癌组织中ULK1 的表达量明显高于癌旁组织，表明NSCLC 中ULK1 表达上调。分析其原因，ULK1 参与构成ULK 复合物，ULK 复合物诱导自噬的发生。有研究发现，ULK 复合物直接受mTOR 和AMP 活化蛋白激酶（AMPK）的调控，其在肿瘤中的表达促进ULK1 的表达[20]。此外，本研究中NSCLC癌组织中ULK1 的表达与肿瘤TNM 分期及淋巴结转移有关，表明ULK1 可能促进NSCLC 肿瘤的发生、发展。有学者报道，肿瘤中ULK1 的过度活化增强线粒体自噬能力，促进NLRP3 炎症小体过度激活，大量趋化因子的分泌导致肿瘤细胞的骨转移[21]。有研究发现，自噬在肿瘤发展的各个阶段会有所不同，在肿瘤发展的早期，自噬通过直接杀伤来限制肿瘤细胞的增殖。然而，在肿瘤已经形成之后，对缺血缺氧压力的反应增加肿瘤细胞的存活、侵袭和转移[22]。因此，ULK1 在肿瘤进展期及晚期中可能发挥更为重要的肿瘤促进功能。

笔者进一步分析NEDD4L、ULK1 与NSCLC 患者生存预后关系，结果NEDD4L 阴性表达、ULK1 阳性表达的NSCC 患者生存预后较差，提示NEDD4L、ULK1 是判断NSCLC 患者预后的重要指标。本研究利用单因素及多因素Cox 回归分析发现，肿瘤TNM分期Ⅲ期、NEDD4L 阴性表达和ULK1 阳性表达是NSCLC 患者不良预后的独立危险因素。因此，NEDD4L、ULK1 是重要的NSCLC 的肿瘤标志物，检测NSCLC 癌组织中NEDD4L、ULK1 的表达有助于患者的预后。笔者发现，NSCLC 癌组织中NEDD4L 与ULK1 的表达呈负相关，表明两者可能存在相互作用的关系。LEE 等[23]报道，NEDD4L 通过降低抑制肿瘤细胞ULK1 的磷酸化激活，抑制自噬和线粒体代谢，从而抑制胰腺癌细胞的增殖。因此，在NSCLC 中NEDD4L 通过对ULK1 活性的调控，进而影响肿瘤细胞的线粒体代谢过程，影响肿瘤的发生、发展。但NSCLC 中两者的具体作用机制有待深入探索。

综上所述，NSCLC 中NEDD4L 表达下调，ULK1表达上调，两者表达与肿瘤TNM 分期及淋巴结转移有关。NEDD4L 低表达、ULK1 的高表达的NSCLC 患者预后较差，且是NSCLC 患者不良生存预后的独立危险因素，其有望成为新的判断NSCLC 预后的分子标志物。但本研究样本例数有限，且是回顾性研究，有待今后设计大样本、前瞻性临床研究证实。