◎ 杨江东，刘建学,2,3，韩四海,2,3，李佩艳,2,3，郭金英,2,3，罗登林,2,3

（1.河南科技大学 食品与生物工程学院，河南 洛阳 471023；2.河南省食品原料工程技术研究中心，河南 洛阳 4710233；3.食品加工与安全国家级实验教学示范中心，河南 洛阳 471023）

急性痛风性关节炎（Acute Gouty Arthritis，AGA） 是由于人体内血尿酸含量过高导致尿酸钠析出结晶在关节腔内，在机体远端关节出现疼痛和炎症反应，发作时间较快，疼痛迅速[1]。痛风一般与尿酸排泄减少而引发的高尿酸血症直接相关，主要临床表现为血尿酸升高，关节红肿疼痛，皮肤温度升高。由于尿酸过高会导致人体肾脏的负担，严重者会发生关节破坏，并伴有其他疾病的病发，如高血压及冠心病、糖尿病等[2-3]。目前临床上干预AGA主要有两种应对措施：对于急性发作期的治疗要及时用药物干预，进行抗炎止痛，常用药物为吲哚美辛、双氯芬酸[4]；对于发作间歇期要控制血尿酸水平，控制饮食，不吃高嘌呤食物（如动物肝脏、海鲜等）、高果糖食物，多吃低嘌呤食物等[5-6]。

葡萄是葡萄科葡萄属木质藤本的一种植物，营养价值很高，多吃可以增强脾胃，除此之外葡萄还具有抗炎症和抗血小板凝聚、抗癌症等功能[7-8]。研究表明葡萄中白藜芦醇具有显著的降血尿酸和抗炎活性，葡萄中所含槲皮素可以明显降低痛风模型大鼠足趾肿胀度[9-11]。葡萄蒸馏酒是葡萄发酵后经蒸馏而成的一种酒精浓度高于原发酵产物的酒精饮料，同样具有一定的保健效果[12]。研究表明葡萄酒中所含嘌呤含量很少，极低于相同质量黄酒及白酒中的嘌呤量[13]。研究表明饮用葡萄酒不会增加痛风发作的风险，葡萄酒可以降低痛风大鼠的炎症反应，但目前较少有人研究葡萄蒸馏酒与痛风之间的关系[14-15]。本课题组前期对葡萄蒸馏酒的饮用人群进行调查，部分饮用者反馈葡萄蒸馏酒适量饮用可以缓解痛风的疼痛。因此本实验预计通过葡萄蒸馏酒灌胃及AGA造模来探究葡萄蒸馏酒对AGA小鼠关节肿胀度和血清生化指标的影响，初步讨论产生干预效果的原因，为下一步葡萄蒸馏酒中微量成分对AGA小鼠的干预研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物

无特定病原体（SPF级）6～8周龄雄性昆明小鼠96只，22～38 g，购自河南科技大学实验动物中心。实验动物许可证号：SYXK（豫）2020-0008，小鼠自由摄食饮水，于河南科技大学食品与生物工程学院动物饲养室分笼饲养，饲养室温度（20±2）℃，湿度50%～55%，每天12 h光照12 h黑暗饲养7 d。本实验在确保实验可行性的同时减少实验动物的数量，所有实验结束后，小鼠均以颈椎脱臼法处死，动物尸体进行无害化处理，本实验遵循实验动物的生物伦理学要求。

1.2 试剂与材料

葡萄蒸馏酒（46°、52°、60°），河南九朝雅宴酒业有限公司提供；无水乙醇、乙醚（分析纯）天津市德恩化学试剂有限公司提供；吲哚美辛（99%）、尿酸钠（98%），上海麦克林生化科技有限公司提供；4%多聚甲醛固定液，广州赛国生物科技有限责任公司提供；丙二醛试剂盒（Malondialdehyde，MDA）（批号：20211203）、超氧化物歧化酶试剂盒（Superoxide Dismutase，SOD）（批号：20211122）、过氧化氢酶试剂盒（Catalase，CAT）（批号：20211202），南京建成生物工程研究所提供；小鼠肿瘤坏死因子-α（Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α）试剂盒（批号：202112046）、小鼠白细胞介素-1β（interleukin-1β，IF-1β）试剂盒（批号：202112046）上海钰博生物科技有限公司提供。

1.3 仪器与设备

BSA1245型分析天平，北京赛多利斯科学仪器有限公司产品；HH-S4型电热恒温水浴锅，北京科伟永兴仪器有限公司产品；单联万用电炉，北京科伟永兴仪器有限公司产品；JE502型电子天平，上海浦春计量仪器有限公司产品；D3024R型高速冷冻离心机，长沙湘仪离心机仪器有限公司产品；752G紫外可见分光光度计，上海仪电分析仪器有限公司产品；XFS-280型手提式压力蒸汽灭菌器，浙江新丰医疗器械有限公司产品；XW-80A型涡旋振荡器，海门市其林贝尔仪器制造有限公司产品；电子数显卡尺，桂林量具刃具有限责任公司产品；Multiskan型多功能酶标仪，赛默飞世尔（上海）仪器有限公司产品。

1.4 实验方法

1.4.1 小鼠的分组与给药

将96只雄性昆明小鼠适应性培养7 d，饲养过程中，每日观察小鼠形态行为，精神状态。适应性饲养7 d后将小鼠随机分为12组，每组8只，分别为空白对照组、模型组、葡萄蒸馏酒（46°、52°、60°）低中高（1 mL·kg-1、2 mL·kg-1、4 mL·kg-1）剂量组、吲哚美辛组（0.075 mg·kg-1）。空白对照组及模型组灌胃蒸馏水，葡萄蒸馏酒各个剂量组分别灌胃对应剂量的葡萄蒸馏酒，吲哚美辛组灌胃吲哚美辛溶液，每天给药1次，灌胃体积为10 mL·kg-1，连续灌胃7 d。

1.4.2 小鼠的造模及指标的测量

（1）模型的制备。小鼠连续灌胃7 d进行造模。造模前用游标卡尺记录每只小鼠右足掌的厚度和宽度，空白对照组用20 μL无菌生理盐水注射小鼠右侧后肢踝关节。模型组和各个剂量葡萄蒸馏酒组及吲哚美辛组：用无菌注射器将20 μL尿酸钠晶体混悬液（含1 mg尿酸钠晶体）注射小鼠右侧后肢踝关节。注射时应注意无菌操作。

（2）模型具体制备过程。小鼠在密闭的容器内用乙醚进行麻醉，时刻关注小鼠的状态，防止小鼠乙醚麻醉过量导致小鼠死亡，小鼠麻醉后进行固定，选择小鼠的右后肢进行操作，用碘伏浸润的脱脂棉签对小鼠足趾部进行消毒，用注射器吸取20 μL尿酸钠溶液在右后足足侧远端进行注射，防止因注射部位太近导致注射液的漏出，注射时以对侧关节囊鼓起为注入成功标准[16]，注射完成后对小鼠注射部位按压止血，用碘伏进行消毒，防止伤口感染发炎，观察造模后小鼠右后足趾部有无出现明显肿胀，有无液体溢出[17]。

1.4.3 小鼠血清指标的测量

小鼠处死前12 h禁食不禁水，小鼠采用眼球采血，采血前将小鼠胡子剪去并对小鼠眼眶周围皮肤进行消毒，防止采集的血液溶血，采血后小鼠脊椎脱臼处死，尸体无害化处理。采集后的血液室温静置1 h，在高速冷冻离心机中以4 ℃，3 000 r·min-1条件下离心15 min，分离上层血清，采用试剂盒检测方法用紫外可见分光光度计及多功能酶标仪检测各组小鼠血清CAT、SOD活性以及MDA、TNF-α、IF-1β含量[18]。操作过程严格按照相应试剂盒说明书操作。

1.4.4 小鼠关节肿胀度的测量及关节滑膜切片的制备

尿酸钠晶体混悬液注射于小鼠右侧后肢踝关节后，用游标卡尺测量小鼠注射尿酸钠溶液后2 h、4 h、6 h、8 h和12 h的双侧后肢足掌厚度及宽度并记录，按公式（1）计算足趾肿胀度。在注射后24 h处死小鼠，取下小鼠右侧后肢踝关节，以踝关节为中心取长度为0.5 cm的组织为测定样本，用无菌生理盐水冲洗后，用4%多聚甲醛溶液固定，于室温下固定24 h，选择脱钙液乙二胺四乙酸（Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，EDTA）于室温下进行脱钙处理，脱钙2周后，石蜡包埋，沿矢状面进行切片，之后对切片进行苏木精-伊红（Hematoxylin-eosin，HE）染色，光学显微镜下观察各组小鼠踝关节滑膜组织病变及炎性细胞浸润情况。

式中：X为足趾肿胀度；mm；A1为给药后足趾厚度，mm；A2为给药后足趾宽度，mm；B1为给药前足趾厚度，mm；B2为给药前足趾宽度，mm。

1.5 数据分析

数据应用SPSS 25.0软件进行统计学分析，采用GraphPad Prism 8.0软件绘图，各组结果以±s的形式表示，多组间比较首先采用单因素方差分析，再采用LSD-t检验进行两两比较，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 葡萄蒸馏酒对AGA小鼠关节肿胀度的影响

各组别小鼠注射尿酸钠后不同时间足趾肿胀度如表1所示，造模后12 h小鼠足趾肿胀度如图1所示，小鼠在构造AGA模型后，关节处会出现明显肿胀，关节肿胀度会显著增加[19]。由于空白对照组注射的为生理盐水，因此由于空白对照组小鼠关节的吸收作用小鼠足趾肿胀度会迅速下降，空白对照组4 h、6 h、 8 h、12 h的肿胀度相较2 h明显下降，而模型组下降幅度没有空白对照组大，且模型组12 h的肿胀度相较空白对照组12 h极显著升高（P＜0.001），这证明小鼠AGA模型构造成功。图1为各小鼠造模后12 h的肿胀度，图中可以发现吲哚美辛组及46°低剂量组小鼠足趾肿胀度相较模型组显著下降（P＜0.05），说明46°低剂量葡萄蒸馏酒可以显著降低模型小鼠足趾肿胀度，但效果不如吲哚美辛。46°中剂量也有下降的趋势但不显著（P＞0.05），而52°中剂量组和60°低剂量组则会使小鼠足趾肿胀度显著或极显著升高（P＜0.05）或（P＜0.01），说明52°中剂量和60°低剂量葡萄蒸馏酒可以升高模型小鼠足趾肿胀度，剩余的组别与模型组相比虽也有上升或下降的趋势但是无显著差异（P＞0.05）。

表1 12 h内葡萄蒸馏酒对AGA小鼠足趾肿胀度的影响表（单位：mm，n=8）

图1 造模后12 h小鼠足趾肿胀度图

2.2 葡萄蒸馏酒对AGA小鼠体重的影响

各组别小鼠不同时间体重如表2所示，小鼠体重是表达小鼠健康程度的重要指标[18]。经统计学分析，实验后一周小鼠体重相较实验前小鼠体重出现了明显增加，但各组增加的量没有显著差异（P＞0.05）， 而在后续AGA造模过程中，各组的实验小鼠体重均减少，各组之间体重变化不显著（P＞0.05），这表示葡萄蒸馏酒在灌胃小鼠的过程中对小鼠体重无显著性影响。但小鼠在实验后一周造模时，各组小鼠体重均下降，这说明小鼠在构造AGA模型的过程中会导致小鼠食欲减退，体重下降，但各个组别之间无显著差异（P＞0.05）。

表2 实验小鼠体重变化表（单位：g，n=8）

2.3 葡萄蒸馏酒对AGA小鼠血清SOD、CAT活性的影响

各组别小鼠血清中SOD和CAT活性水平如表3所示，SOD和CAT是参与痛风的两种关键酶，研究发现部分药物可以通过提高这两种酶的活性从而提高抗氧化活性发挥治疗痛风性关节炎的功效[20-21]。由 表3可知，52°中剂量组与60°高剂量组，两组别相较于模型组超氧化物歧化酶活性显著下降（P＜0.05），证明高酒精度的葡萄蒸馏酒可能会使AGA小鼠炎症反应加剧，葡萄蒸馏酒由低剂量到高剂量，SOD水平依次降低，这说明随着葡萄蒸馏酒剂量的升高，会降低AGA小鼠血清SOD的活性。表3中各个剂量组葡萄蒸馏酒小鼠血清CAT活性均较模型组升高，其中52°低剂量组显著升高（P＜0.05）和60°低、高剂量组及吲哚美辛组极显著升高（P＜0.01），表3中可以明显看到随着葡萄蒸馏酒度数和剂量的升高，CAT活性显著升高，这表明该葡萄蒸馏酒中含有能升高小鼠血清CAT活性的微量成分。

表3 葡萄蒸馏酒对AGA小鼠血清SOD、CAT的影响表（单位：U·mL-1，n=8）

2.4 葡萄蒸馏酒对AGA小鼠IL-1β及TNF-α含量的影响

各组别小鼠血清中IL-1β、TNF-α水平如图2、图3所示，当小鼠机体发生AGA时，小鼠体内的IL-1β含量以及TNF-α含量会显著上升[22]，IL-1β是炎症反应中非常重要的炎症因子，经常分布在血液或者组织液中，它可以刺激巨噬细胞分泌炎症因子，从而调节炎症反应[23]。TNF-α同样是痛风性关节炎中常见的炎症因子，当机体发生感染、炎症时，TNF-α水平会增高。研究也发现小鼠构造AGA模型成功后，会使小鼠血清中IL-1β和TNF-α水平增高[24]。由图2、图3可知，模型组小鼠血清TNF-α和IL-1β水平均显著升高（P＜0.05），这证明AGA小鼠模型构造成功。研究发现吲哚美辛可以抑制小鼠血清中TNF-α和IL-1β的生成从而降低小鼠的足趾肿胀度[25]，图2、图3中吲哚美辛组TNF-α和IL-1β水平降低或显著降低（P＜0.05），结果符合文献的报道，TNF-α和IL-1β参与慢性疼痛的发生和发展，这表明吲哚美辛可以降低关节炎的疼痛，这与常识一致，也与文献报道的一致[26]。此外，图2中除了60°高剂量组除外，其余各剂量组均可以不同程度的降低小鼠血清中的IL-1β含量，其中46°中剂量组可以显著降低血清中IL-1β含量（P＜0.05），但随着酒精度和剂量的升高，降低效果越来越差，这表明酒精浓度和剂量越低，降低效果越好。由图3知，46°低、高剂量组、60°低、中剂量组都可以降低模型小鼠血清中的TNF-α含量，结合图2的葡萄蒸馏酒对AGA模型小鼠血清IL-1β含量的影响，可以得出低剂量葡萄蒸馏酒可能通过降低模型小鼠血清中的IL-1β和TNF-α水平从而降低AGA小鼠足趾炎症及疼痛。

图2 葡萄蒸馏酒对AGA小鼠IL-1β含量的影响图

2.5 葡萄蒸馏酒对AGA小鼠血清MDA含量的影响

各组别小鼠血清中丙二醇（Malondialdehyde，MDA）含量如图4所示，MDA的含量可以衡量机体细胞受氧化胁迫的程度[18]。在痛风患者中，MDA的含量显著高于健康人群[27]。由图4可知，模型组相较空白对照组，血清中MDA含量极显著升高（P＜0.01），这可以侧面证明小鼠AGA模型构造成功。在构造小鼠AGA模型过程中，除了空白组注射生理盐水外，剩余组别均在小鼠关节腔内注射了尿酸钠晶体。由 图4可知，模型组、葡萄蒸馏酒各组别及吲哚美辛组相较空白对照组血清MDA含量升高（P＜0.05），除60°中剂量组外其余各组别MDA含量与模型组无显著差异（P＞0.05），这说明葡萄蒸馏酒干预AGA的过程并非通过血清中MDA来实现的。

图3 葡萄蒸馏酒对AGA小鼠血清中TNF-α含量的影响图

图4 葡萄蒸馏酒对AGA小鼠血清MDA含量的影响图

2.6 小鼠关节滑膜组织染色观察

各组别小鼠关节滑膜切片如图5所示，由图5可知正常组小鼠关节组织完整，关节腔内干净，关节表面光滑，关节间组织无充血水肿，滑膜细胞无增生，没有炎症发生。模型组关节腔内组织炎症明显，组织表面由滑膜增生，关节腔内有炎性渗出物，周围软组织有炎性细胞浸润。46°低、中剂量组及吲哚美辛组对比模型组滑膜细胞增生明显减轻，充血情况也同样减少，52°低、中剂量组及60°低剂量组关节腔内充血严重，可见滑膜充血肿胀至关节腔内，这表明52°低中剂量组及60°低剂量组小鼠关节肿胀严重，结果与图1小鼠造模后12 h小鼠足趾肿胀度吻合，各组小鼠关节滑膜切片表明46°低中剂量组葡萄蒸馏酒可以缓解AGA小鼠炎症反应。高剂量组的葡萄蒸馏酒会使小鼠关节滑膜损伤加重，所示结果与图1所示一致。

3 结论

本文中所用的AGA模型构造方法较为经典，采取对小鼠关节腔内注射尿酸钠溶液的方式，使小鼠关节腔因为外来异物的损伤作用及尿酸钠的破坏作用出现关节炎症，构造时间短，构造方便，并且根据需要可以选择预防性给药或治疗型给药，此方法经常被用于抗痛风物质的筛选上[28]。文中采用预防性给药的方法，先用葡萄蒸馏酒及相应药物对小鼠进行灌胃，而后对小鼠进行AGA模型造模，通过测量注射尿酸钠溶液后小鼠关节肿胀度以及血清内相应酶活性判断葡萄蒸馏酒对AGA小鼠的干预效果。

由实验结果可知，46°低剂量的葡萄蒸馏酒可以显著抑制小鼠AGA足趾肿胀度（P＜0.05），原因可能是葡萄蒸馏酒中微量成分降低小鼠血清中IL-1β及TNF-α水平实现的，但是随着酒精度和剂量的提高，52°中剂量组和60°低剂量组则会使小鼠足趾肿胀度显著或极显著升高，原因可能是酒中乙醇含量的升高，乙醇代谢产生乙酸竞争性抑制尿酸的排泄，乙醇代谢过程中会快速消耗三磷酸腺苷（Adenosine Triphosphate，ATP），也会使尿酸产生增加，最终导致小鼠体内的尿酸升高；当外部注射尿酸钠溶液时，小鼠体内的尿酸含量水平较高，尿酸钠不能及时溶解，故52°中剂量组和60°低剂量组使得AGA模型小鼠关节肿胀度显著升高。

通过对小鼠体内酶活性水平的统计分析发现，52°中剂量组和60°高剂量组小鼠SOD水平显著降低，说明这两组小鼠的关节肿胀度可能会因为酶活性的降低而导致炎症加剧，观察图1小鼠足趾肿胀度发现这两组小鼠足趾肿胀度相较模型组显著增加，而CAT活性水平与葡萄蒸馏酒存在剂量相关性，这说明该葡萄蒸馏酒中含有提高小鼠血清CAT活性的微量成分。通过对小鼠关节滑膜切片可以看出，46°低、中剂量的葡萄蒸馏酒可以明显减少关节滑膜的充血面积，减轻炎症反应。其抗炎机制可能是与葡萄蒸馏酒升高小鼠体内CAT活性以及降低小鼠血清中IL-1β及TNF-α水平相关。52°各个剂量组关节滑膜充血严重，故52°各个剂量组关节肿胀度相较其他组别明显偏高。60°各剂量组可能由于乙醇升高尿酸作用和小鼠体内酶活性以及炎症因子的多重作用下导致60°高剂量组小鼠肿胀度反而相较52°各剂量组下降，但仍与模型组无显著性差异（P＞0.05），且大于空白组。具体机理有待更深层次的实验的进一步研究。

综上所述，适量饮用46°葡萄蒸馏酒可以升高AGA模型小鼠血清中CAT活性，降低AGA模型小鼠血清中TNF-α和IL-1β含量，减轻关节滑膜损伤，从而降低AGA模型小鼠关节肿胀度及减轻疼痛。但由于葡萄蒸馏酒中成分复杂，机体代谢过程具有多种途径，因此葡萄蒸馏酒中具体功效成分及相关代谢机理还需要进一步研究及分析。