◎ 路 畅，刘佳哲，吴小芝，张东娜，王喜萍

(吉林农业科技学院，吉林 吉林 132001）

目前，国内外关于大豆分离蛋白-多糖美拉德反应的研究大多以美拉德反应机理的研究为主，其原材料多糖使用葡萄糖、乳糖、麦芽糖较多，本试验原材料壳聚糖的选择相对比较新颖。对于反应产物的研究现有的多是抑制褐变、保鲜以及和氨基酸（酪氨酸）的相互作用等方面，有关其功能特性的研究少之又少，此次试验将为以后的研究提供依据。

已知大豆分离蛋白是以大豆粕为原料生产的食品添加剂，营养全面，是可替代动物蛋白的植物蛋白，含约90%蛋白质，氨基酸种类齐全[1-3]。单独的大豆分离蛋白无法拥有多个特性，难以进一步应用，因此对大豆分离蛋白进行改性，具有重要意义[2-3]。甲壳素N-脱乙酰基生成碱性多糖壳聚糖，与甲壳素、纤维素化学结构相近，具有细胞亲和性、生物降解性和生物效应等性质，壳聚糖2C位上是氨基，与甲壳素、纤维素不同，活性更强，因此具有更优异的生物学功能，可用于化学修饰[4]。本试验以二者为原料进行美拉德反应（天然化学改性），进一步提升蛋白质的功能特性(如乳化活性、乳化稳定性、起泡性和溶解性等)[5]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大豆分离蛋白(山东爱采生物科技有限公司）；壳聚糖(苏州美亿辰生物科技有限公司)。

DPPH粉末、HCl、NaOH、NaCl、甲醇、pH 7.0的磷酸缓冲液及十二烷基硫酸钠（均为天津市鼎盛鑫化工有限公司）；花生油（市售）；试验用水均为蒸馏水。

1.2 仪器与设备

AL-2045电子天平，上海菁海仪器有限公司；HH-4恒温水浴锅，国华电器有限公司；SY-720超声波清洗机，昆山超声仪器公司；BCD-221WDPT冰柜，青岛海尔股份有限公司；DHL-820A恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；H2050R高速冷冻离心机，湖南湘仪试验室仪器开发有限公司；SK-1快速混匀器，金坛市城东新瑞仪器厂；V-721PC紫外分光光度计，上海驰唐仪器设备有限公司。

1.3 大豆分离蛋白-壳聚糖美拉德反应条件优化

1.3.1 工艺流程

大豆分离蛋白-壳聚糖美拉德反应产物制备的工艺流程为：大豆分离蛋白+壳聚糖→混合→搅拌→调pH→反应釜反应→冷却→透析→不同分子量美拉德反应产物。

1.3.2 0.1 mol·L-1DPPH溶液的配制

用分析天平称取DPPH粉末0.004 g，用甲醇溶解，100 mL容量瓶定容，制得0.1 mol·L-1的DPPH溶液。

1.3.3 测定美拉德反应产物DPPH清除率

取3只比色管，分别加入以下物质。①加入样液2 mL、0.1 mol·L-1DPPH溶液6 mL。②加入样液2 mL、甲醇溶液6 mL。③加入甲醇溶液2 mL、0.1 mol·L-1DPPH溶 液6 mL。然 后 分 别 以3 500 r·min-1离 心 20 min，测定其在517 nm波长的吸光度。美拉德反应产物DPPH清除率的计算公式为：

美拉德反应产物DPPH清除率=

式中：A1为管①的吸光值；A2为②管的吸光值；A3为③管的吸光值。

1.4 单因素试验

在试验中，有许多的因素影响大豆分离蛋白-壳聚糖美拉德反应产物的生成。主要有大豆分离蛋白∶壳聚糖（质量比）、反应温度、反应时间以及反应pH。

1.4.1 大豆分离蛋白∶壳聚糖（质量比）对大豆分离蛋白-壳聚糖美拉德反应的影响

将大豆分离蛋白与壳聚糖按1.0∶0.5、1.0∶1.0、1.0∶1.5、1.0∶2.0和1.0∶2.5（质量比）比例配制反应物，进行大豆分离蛋白与壳聚糖的美拉德反应，反应温度60 ℃，反应时间80 min，反应pH值为4，以反应产物的DPPH清除率为考察指标，确定大豆分离蛋白∶壳聚糖的较佳值。

1.4.2 反应温度对大豆分离蛋白-壳聚糖美拉德反应的影响

按优化的大豆分离蛋白-壳聚糖配制反应物(从试验中得到的质量比），分别选取反应温度40 ℃、 50 ℃、60 ℃、70 ℃和80 ℃，进行大豆分离蛋白与壳聚糖的美拉德反应，反应80 min，反应pH值为4，以反应产物的DPPH清除率为考察指标，确定大豆分离蛋白-壳聚糖美拉德反应的较佳反应温度。

1.4.3 反应时间对大豆分离蛋白-壳聚糖美拉德反应的影响

按优化的大豆分离蛋白-壳聚糖配制反应物（从试验中得到的质量比、反应温度），分别选取提取时间40 min、60 min、80 min、100 min和120 min，反应pH值为4，进行大豆分离蛋白与壳聚糖的美拉德反应，以反应产物的DPPH清除率为考察指标，确定大豆分离蛋白-壳聚糖美拉德反应的较佳反应时间。

1.4.4 反应pH对大豆分离蛋白-壳聚糖美拉德反应的影响

按优化的大豆分离蛋白-壳聚糖配置反应物（从试验中得到的质量比、反应温度、反应时间），分别选取提取pH值为2.0、3.0、4.0、5.0和6.0，进行大豆分离蛋白与壳聚糖的美拉德反应，以反应产物的DPPH清除率为考察指标，确定大豆分离蛋白-壳聚糖美拉德反应的较佳反应pH。

1.5 正交试验设计

根据单因素试验的结果，以大豆分离蛋白-壳聚糖质量比、反应的温度、时间以及pH为影响因素，DPPH清除率为评价指标，完成正交试验，确定最优反应组合。因素水平表见表1。

表1 正交试验因素水平表

1.6 大豆分离蛋白-壳聚糖美拉德反应产物的纯化（样品纯化）

以正交试验得出的最优反应条件组合进行大豆分离蛋白-壳聚糖美拉德反应产物的制备。采用3 500 Da 和8 000 Da的透析袋进行透析，得到分子量＜3 500 Da、 分子量为3 500～8 000 Da、分子量＞8 000 Da的样液，烘干后得到样品，用于功能特性的测定。

1.7 大豆分离蛋白-壳聚糖美拉德反应产物功能特性的测定

1.7.1 乳化活性的测定

称样品0.1 g溶解于20 mL、pH值为7.0的PBS缓冲液（0.05 mol·L-1），充分搅拌，水化30 min，加入 4.0 mL花生油，均质（8 000 r·min-1、1 min）。迅速从乳液下端量取100 L乳浊液，离散到10 mL 0.1%的月桂醇硫酸钠溶液中，于500 nm波长下测定该稀释液的吸光度A0，吸光度A0与界面面积呈正相关[6-7]。乳化活性的计算公式如下：

式中：A为大豆分离蛋白，m²·g-1；n为稀释倍数；ϕ为体系中油相所占的比例，本试验为0.2；c为蛋白质溶液的浓度，g·mL-1；l为比色池光径，本试验为1 cm。

1.7.2 乳化稳定性的测定

上述样品静置15 min，从下端量取100 μL乳浊液，离散于10 mL 0.1%的月桂醇硫酸钠溶液中，测定 500 nm波长的吸光度At[6-7]。乳化稳定性以es表示，计算公式如下：

式中：A0为0时刻吸光值；An为n时刻时吸光值；ΔA为Δt内吸光值差。

1.7.3 起泡性的测定

起泡性的测定采用搅打发泡测定法，即用pH值为7.0的PBS缓冲溶液溶解样品，配成3%的乳浊液。取200 mL 3%乳浊液，打泡（8 000 r·min-1、3 min），测泡沫体积，记录为V0[8-9]。按下式计算起泡度（FAI）：

静置30 min，测泡沫体积，记录为VT[7-8]。按下式计算泡沫稳定性（FS）：

1.7.4 溶解性的测定

称取样品100 mg，15 mL蒸馏水溶解，用低浓度NaOH或HCl溶液调节pH，搅拌30 min，离心 （4 000 r·min-1、30 min）。凯氏定氮法测定该pH条件下可溶性蛋白质含量及总氮含量[8-9]。溶解度计算公式如下：

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果与分析

2.1.1 大豆分离蛋白-壳聚糖质量比对大豆分离蛋白-壳聚糖美拉德反应产物的影响

由图1可知，随着大豆分离蛋白-壳聚糖质量比的减小，DPPH清除率呈现出先增大后减小的趋势，大豆分离蛋白-壳聚糖质量比为1.0∶1.0的DPPH清除率最大，即大豆分离蛋白-壳聚糖美拉德反应产物的物料比为1.0∶1.0时产量最优。

图1 大豆分离蛋白∶壳聚糖（质量比）对反应产物的影响图

2.1.2 反应温度对大豆分离蛋白-壳聚糖美拉德反应产物的影响

由图2可知，随着反应温度的升高，DPPH清除率呈现出先增大后减小的趋势，反应温度为50 ℃的DPPH清除率最大，即大豆分离蛋白-壳聚糖美拉德反应产物的反应温度为50 ℃时为最优反应条件。

2.1.3 反应时间对大豆分离蛋白-壳聚糖美拉德反应产物的影响

由图3可知，随着反应时间的增加，DPPH清除率呈现出先增大后减小的趋势，反应时间为80 min的DPPH清除率最大，即大豆分离蛋白-壳聚糖美拉德反应产物的反应时间为80 min时产量最优。

图3 反应时间对大豆分离蛋白-壳聚糖美拉德 反应产物的影响图

2.1.4 反应pH对大豆分离蛋白-壳聚糖美拉德反应产物的影响

由图4可知，随着pH值的增大，DPPH清除率呈现出先增大后减小的趋势，pH值为4的DPPH清除率最大，即大豆分离蛋白-壳聚糖美拉德反应产物的反应pH值为4时产量最优。

图4 反应pH对大豆分离蛋白-壳聚糖美拉德 反应产物的影响图

2.2 正交试验结果分析

以DPPH清除率为考察指标，在单因素试验的基础上，分别选取大豆分离蛋白∶壳聚糖（质量比）、反应温度、反应时间以及反应pH 4个影响因素的3个较佳水平，进行L9(34)正交试验，最终确定最佳反应条件。试验结果见表2。

表2 正交试验结果表

由表2可知，4种因素的主次顺序是反应pH＞反应时间＞质量比＞反应温度，其中反应pH影响程度明显最大。根据表中的极差分析法可以对最优水平进行判断，最佳设计方案为A1B2C2D2（46.9%），而由K值分析可知，最佳组合应为A2B2C2D2，因此对两种组合分别做3次试验验证，再求其平均值。试验验证结果表明，A1B2C2D2组合条件下的美拉德反应产物DPPH清除率为46.3%，A2B2C2D2组合条件下的美拉德反应产物DPPH清除率为为48.7%，因此A2B2C2D2为最佳条件，即最佳反应条件为大豆分离蛋白∶壳聚糖（质量比）1∶1，反应温度50 ℃，反应时间 80 min，反应pH 4。

2.3 大豆分离蛋白-壳聚糖美拉德反应产物功能特性的测定

2.3.1 乳化活性的测定结果

根据公式（2）计算样液的乳化活性，结果如图5所示。大豆分离蛋白-壳聚糖美拉德反应产物会透析成不同分子量的反应产物，分子量为3 500～8 000 Da的DPPH清除率较高，即该阶段的反应产物乳化活性较好。分子量＜3 500 Da和分子量＞8 000 Da的美拉德反应产物的DPPH清除率相差不多，其乳化活性相似。

图5 乳化活性的测定结果图

2.3.2 乳化稳定性的测定结果

根据公式（3）计算样液乳化稳定性，结果如图6 所示。大豆分离蛋白-壳聚糖美拉德反应产物会透析成不同分子量的反应产物，3 500～8 000 Da的美拉德反应产物的DPPH清除率较高，即该阶段的反应产物乳化稳定性较好。

图6 乳化稳定性的测定结果图

2.3.3 起泡性的测定结果

按公式（4）计算样液起泡度，结果如图7所示。大豆分离蛋白-壳聚糖美拉德反应产物会透析成不同分子量的反应产物，3 500～8 000 Da的美拉德反应产物的DPPH清除率较高，即该阶段的反应产物起泡度较好。分子量＜3 500和分子量＞8 000的美拉德反应产物的DPPH清除率相差不大，其起泡度 相似。

按公式（5）计算样液起泡稳定性，结果如图8所示。大豆分离蛋白-壳聚糖美拉德反应产物会透析成不同分子量的反应产物，3 500～8 000 Da的美拉德反应产物的DPPH清除率较高，即该阶段的反应产物起泡稳定性较好。分子量＜3 500 Da和分子 量＞8 000 Da的美拉德反应产物的DPPH清除率相差不大，其起泡稳定性相似。

图7 起泡度的测定结果图

图8 起泡稳定性的测定结果图

2.3.4 溶解性的测定结果

利用公式（6）计算溶解度，结果如图9所示。大豆分离蛋白-壳聚糖美拉德反应产物会透析成不同分子量的反应产物，3 500～8 000 Da的美拉德反应产物的DPPH清除率较高，即该阶段的反应产物溶解性较好。分子量＜3 500 Da和分子量＞8 000 Da的美拉德反应产物的DPPH清除率相差不大，其溶解性相似。

3 结论

本试验以大豆分离蛋白和壳聚糖为原料在反应釜内进行美拉德反应，使大豆分离蛋白得到化学改性，使其功能特性得到提高。实验结果表明，不同的物料比、反应温度、反应时间和反应pH都会影响大豆分离蛋白与壳聚糖美拉德反应产物的生成，由单因素试验和正交试验得出最佳反应条件为大豆分离蛋白∶壳聚糖（质量比）1∶1、反应温度50 ℃、反应时间80 min、pH 4。该研究结果将为大豆分离蛋白-壳聚糖美拉德反应的制备起到指导性作用。利用上述试验结果，进行反应产物的制备，并用透析袋进行透析得到不同分子量（＜3 500 Da、3 500～8 000 Da、＞ 8 000 Da）的美拉德反应产物，进行功能特性的分析。结果表明3 500～8 000 Da的美拉德反应产物的乳化活性、乳化稳定性、起泡性以及溶解性最高， 而＜3 500 Da 和＞8 000 Da的美拉德反应产物的各个功能特性相近。美拉德反应是蛋白质化学改性的天然方法，能够使其功能特性得到一定程度的提高。