赵 欣，孟德义，苍 晶，徐庆华，张 达

(东北农业大学生命科学学院，黑龙江哈尔滨 150030)

低温作为一种常见的非生物胁迫因子，严重影响植物的生长发育和地理分布[1]。当环境温度低于植物正常的承受范围，会引起植物体内生理代谢功能紊乱，严重时可导致植物死亡[2]。研究发现，植物激素参与调节植物对低温胁迫的响应[3]。水杨酸(salicylic acid，SA)，化学名称为邻羟基苯甲酸，是一种天然酚类化合物，常作为重要的信号分子在调节植物生长发育、种子萌发、抵御生物和非生物胁迫过程中起重要作用[4-5]。低温胁迫下，拟南芥[6]、玉米[7]和小麦[8]等植物中内源SA的含量显著升高并伴随着抗寒性增强。外源SA处理提高了低温下香蕉[9]、菠菜[10]、柠檬[11]等植物体内抗氧化物含量和抗氧化酶活性，清除活性氧(ROS)能力提高，缓解了低温造成的氧化损伤。此外，外源SA还可以增加玉米的叶绿素和类胡萝卜素等光合色素的含量，缓解低温对幼苗生长的抑制，提高玉米抗寒性[12]。可见，SA在参与植物低温胁迫应答中扮演重要角色。

糖酵解(glycolysis，EMP)是高等植物体内重要的一条呼吸代谢途径，能够为植物生长发育提供ATP、还原力和代谢物，与植物响应低温、干旱、盐碱、重金属等非生物胁迫密切相关[13]。己糖激酶(hexokinase,HxK)、磷酸果糖激酶(phosphofructokinase,PFK)和丙酮酸激酶(pyruvatekinase,PK)是EMP代谢途径中的三个关键酶。低温胁迫下植物的EMP代谢增强，HxK、PFK和PK活性升高，促进糖类物质的分解与丙酮酸的积累，释放大量能量以抵御低温胁迫[14]。

研究表明，外源SA可促进植物在低温下可溶性糖的积累，维持细胞内外的渗透平衡[15]；通过调节糖代谢途径相关酶基因的表达，提高植物的抗寒性[16]。我们前期的研究发现，外源SA可提高低温胁迫下冬小麦体内蔗糖含量、蔗糖合成相关酶(蔗糖合成酶SuS和蔗糖磷酸合成酶SPS)活性及关键基因(TaSuS、TaSPS)的表达，降低了蔗糖分解代谢相关酶(可溶性酸性转化酶SAInv和碱性转化酶A/N-Inv)活性及其基因(TaSAInv、TaA/N-Inv)的相对表达水平[17]。然而，外源SA对低温胁迫下冬小麦EMP途径的影响尚未见报道，SA是否影响EMP途径中关键酶的活性及其基因表达量目前尚不清楚。本研究以强抗寒性冬小麦品种东农冬麦1号和弱抗寒性冬小麦品种济麦22号为试验材料，探讨外源SA对低温胁迫下两种冬小麦EMP代谢中果糖含量、丙酮酸含量和EMP关键酶(HxK、PFK和PK)活性及其相关基因(TaHxK、TaPFK和TaPK)相对表达量的影响，为进一步解析激素调控冬小麦抗寒性提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

冬小麦(TriticumaestivumL.)品种东农冬麦1号(Dn1)和济麦22号(Jm22)由东北农业大学小麦室提供。Dn1(强抗寒性小麦品种)在黑龙江地区保苗率达85 %以上，Jm22(弱抗寒性小麦品种)保苗率小于1%。

试验材料于2019年9月10日在东北农业大学校内试验田播种，完全区组设计，行长2 m，行距0.2 m，播种深度55 cm，常规田间管理。于三叶期(2019年9月24日)对两个冬小麦品种叶片喷施 1 mmol·L-1SA，以喷施等量的蒸馏水为对照。待大田自然降温[18]连续10 d平均最低温度为 5 ℃(2019年10月10日)、0 ℃(2019年10月29日)、-10 ℃(2019年11月25日)和 -25 ℃(2020年1月3日)时，选取长势一致的麦苗，剪取叶片和分蘖节成0.5 cm的小段，液氮速冻， -80 ℃保存备用。

1.2 试验方法

1.2.1 果糖、丙酮酸含量和EMP代谢关键酶活性的测定

果糖、丙酮酸含量测定和EMP代谢关键酶HxK、PFK和PK活性的测定参考刘丽杰[19]方法。

1.2.2 EMP重要酶基因表达量检测

用Trizol法提取小麦叶片和分蘖节的总RNA，cDNA第一条链的合成参照反转录试剂盒(全式金AT311，北京)说明。反应体系20 μL，包括：1 μL RNA，1 μL Oligo(dT)，1 μL gRNA Remover，1 μL Transcript Enzyme Mix，6 μL Rnase-free Water，10 μL 2×Reaction Mix。反应程序：42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。使用Primer 6.0设计TaHxK、TaPFK和TaPK特异性引物，以小麦TaActin为内参基因，引物见表1。按照ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix试剂盒说明书(诺唯赞Q711，南京)反应体系进行PCR。反应程序：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性 10 s,60 ℃退火30 s,40个循环；95 ℃变性15 s， 60 ℃退火60 s，95 ℃变性15 s。采取2-△△Ct方法计算待测基因的相对表达量。3次生物学重复。

表1 qRT-PCR引物Table 1 Primers used in quantitative real-time PCR analysis

1.3 数据分析

采用DPS 7.0进行数据统计多重比较。

2 结果与分析

2.1 外源SA对冬小麦果糖含量的影响

随着温度的降低，两个冬小麦品种叶片和分蘖节中果糖含量均呈先升后降的变化趋势，且均在-10 ℃时达到峰值(图1)。外源SA处理提高了低温下两个品种叶片和分蘖节中的果糖含量(-25 ℃下Jm22分蘖节除外)，Dn1叶片在0 ℃、-10 ℃和-25 ℃时SA处理果糖含量均显著高于对照(图1A)，分蘖节在-10 ℃时SA处理显著高于对照(图1C)；Jm22叶片和分蘖节的果糖含量均在-10 ℃时SA处理显著高于对照(图1B和D)。SA处理下冬小麦分蘖节中果糖含量高于叶片，且Dn1比Jm22积累了更多的果糖。

A:Dn1叶片；B:Jm22叶片；C:Dn1分蘖节；D:Jm22分蘖节。图柱上不同小写字母代表差异显著(P<0.05)。下同。

2.2 外源SA对低温胁迫下冬小麦丙酮酸含量的影响

随着温度的降低，冬小麦叶片和分蘖节中丙酮酸含量均呈先升后降的变化趋势，分别在 -10 ℃和0 ℃时达到峰值(Dn1的SA处理和Jm22对照中分蘖节呈升-降-升的趋势，0 ℃时达到峰值)(图2)。外源SA提高了Dn1分蘖节、-10 ℃和-25 ℃下Dn1叶片、0 ℃和-10 ℃下Jm22叶片和分蘖节中丙酮酸含量，且-25 ℃下的Dn1、0 ℃和 -10 ℃下Jm22分蘖节中SA处理显著高于对照(图2A和C、D)。外源SA处理对Dn1作用更明显。

图2 两个冬小麦品种叶片和分蘖节中丙酮酸含量的变化

2.3 外源SA对低温胁迫下冬小麦EMP代谢关键酶活性的影响

HxK、PFK、PK是EMP代谢的关键酶。随着温度的降低，两个冬小麦品种叶片中HxK活性均先升后降，分别在-10 ℃和0 ℃时达到峰值(图3A和B)；对照组中Dn1和Jm22分蘖节中HxK活性呈逐渐升高和升-降-升的趋势，均在-25 ℃达到峰值(图3C和D)。外源SA处理显著提高了0 ℃和-10 ℃时Dn1叶片、5 ℃和 -10 ℃时Dn1分蘖节中HxK活性(图3A 和C)，也显著提高了0 ℃和-10 ℃时Jm22叶片和分蘖节中HxK活性(图3B和D)。SA处理 下Dn1叶片和分蘖节中HxK活性总体高于Jm22。

图3 两个冬小麦品种叶片和分蘖节中HxK活性的变化

随着温度的降低，两个品种叶片和分蘖节中PFK活性均呈先升后降的变化趋势(除对照组Dn1叶片中PFK活性呈逐渐升高的趋势)，外源SA处理下，Dn1和Jm22叶片和分蘖节中PFK活性分别在-10 ℃(图4A和C)和0 ℃达到峰值(图4B和D)。外源SA处理显著提高了冬小麦叶片和分蘖节在0 ℃和-10 ℃时PFK活性。SA处理后，Dn1分蘖节中PFK活性高于Jm22。

图4 两个冬小麦品种叶片和分蘖节中PFK活性的变化

随着温度的降低，两个品种叶片和分蘖节中PK活性均先升后降(除对照组Jm22叶片中PK活性呈升-降-升的趋势)(图5)。外源SA处理后，Dn1叶片中PK活性在-10 ℃达到峰值(图5A)；而Dn1分蘖节和Jm22叶片和分蘖节中PK活性均在0 ℃达到峰值(图5B～图5D)。外源SA处理显著提高了0 ℃和-10 ℃时Dn1叶片(图5A)及0 ℃时Dn1分蘖节(图5C)中PK活性，显著降低了-25 ℃时Jm22叶片(图5B)和 0 ℃时Jm22分蘖节中PK活性(图5D)。外源SA对Dn1叶片和分蘖节中PK活性影响大于Jm22，且两个品种叶片中PK活性高于分蘖节。

图5 两个冬小麦品种叶片和分蘖节中PK活性的变化

2.4 外源SA对低温胁迫下冬小麦EMP途径关键酶基因表达量变化的影响

随着温度的降低，两个冬小麦品种叶片和分蘖节中TaHxK的相对表达量均呈先升后降的变化趋势，Dn1叶片和分蘖节及Jm22叶片中TaHxK的表达量均在-10 ℃达到峰值，Jm22分蘖节在0 ℃达到峰值(图6A和图6B)。外源SA处理显著提高了0 ℃和-10 ℃时Dn1叶片和分蘖节中TaHxK的相对表达量，显著提高了 -10 ℃和-25 ℃时Jm22叶片、-10 ℃时Jm22分蘖节中TaHxK的相对表达量。

随着温度的降低，两个品种叶片和分蘖节中TaPFK相对表达量也表现出先升后降的变化趋势，叶片中TaPFK表达量均在-10 ℃时达到峰值；而对照分蘖节中TaPFK的相对表达量在 0 ℃达到峰值，SA处理分蘖节中在-10 ℃达到峰值。外源SA处理显著提高-10 ℃时Dn1叶片(图6C)、0 ℃及以下低温Dn1分蘖节、-10 ℃时Jm22分蘖节中TaPFK的相对表达量(图6D)。

随着温度的降低，两个品种叶片和分蘖节中TaPK相对表达量也表现出先升后降的趋势，均在-10 ℃达到峰值(除SA处理下Jm22分蘖节在0 ℃达到峰值)(图6E和图6F)。外源SA处理显著提高了-10 ℃时Dn1叶片、0 ℃及以下低温Dn1分蘖节、0 ℃时Jm22分蘖节中TaPK的相对表达量。

图A、C、E为两种冬小麦叶片；图B、D、F为两种冬小麦分蘖节。同一品种图柱上不同小写字母代表差异显著(P<0.05)。

3 讨 论

糖作为一种渗透调节物质，在逆境条件下可为植物提供能量和碳源[20]。低温胁迫下，植物通过积累大量可溶性糖提高其渗透调节能力并维持生物膜结构的稳定，从而提高抗寒性[21]。植物激素SA可与ABA、ROS、Ca2+等信号途径相互作用，共同激活抗氧化物、脱水蛋白、抗冻蛋白和病程相关蛋白等物质的积累，改善低温对植物造成的伤害[22]。研究表明，外源SA处理通过促进植物可溶性糖的积累提高抗寒性[16,23-24]。我们前期研究也发现，外源SA可以促进低温胁迫下Dn1蔗糖含量的积累[17]。果糖作为一种重要的可溶性糖，是蔗糖水解的产物，可通过磷酸化作用进入EMP和三羧酸循环(TCA)，在抵御外界胁迫中发挥重要作用[25]。本研究发现，低温胁迫提高了Dn1和Jm22叶片和分蘖节中的果糖含量，且强抗寒性品种Dn1比弱抗寒性品种Jm22积累了更多的果糖；外源SA显著提高了两个冬小麦品种叶片和分蘖节中果糖含量，表明SA影响了低温胁迫下的糖代谢，这与前人的研究结果一致[17,23-24]。丙酮酸是EMP途径的最终产物，作为有机酸的重要前体，不仅参与呼吸氧化供能，还与糖代谢、脂肪代谢和TCA等多种关键代谢途径密切相关[26]。本研究中，丙酮酸含量变化与果糖含量变化趋势相似，低温胁迫下两个冬小麦品种丙酮酸含量的积累表现出分蘖节早于叶片达到峰值，说明分蘖节首先启动了防御机制，这与分蘖节作为Dn1越冬的主要器官有关。外源SA显著提高了-25 ℃时Dn1分蘖节中丙酮酸的含量，这可能为TCA提供了足够的原料，产生更多的ATP供能。

植物在逆境下需要消耗大量的能量来提高抗性[27]，而能量的产生主要通过EMP途径。HxK、PFK和PK是EMP途径中的最重要的三个限速酶。在植物体内，HxK可催化多种六碳糖代谢，其中果糖可作为其代谢底物；PFK可将6-磷酸果糖磷酸化形成1，6-二磷酸果糖；丙酮酸是PK的产物。前人研究发现，外源SA通过调节可溶性糖含量和糖代谢途径中相关酶活性影响EMP、TCA和PPP等途径的呼吸强度，延缓果实衰老，延长果实在低温下的贮藏时间[28]。HxK和PFK是和果糖关系最密切的两种酶。本研究发现，外源SA提高了Dn1和Jm22中HxK和PFK活性，且分别在-10 ℃和0 ℃时达到峰值。说明在-10 ℃和0 ℃时冬小麦体内果糖磷酸化的能力最强。有研究指出，非生物胁迫下低水平的HxK活性可以抑制植物衰老，从而提高植物的耐冷性[29-30]，这可能与冬小麦叶片HxK活性在-10 ℃以后下降有关。高活性的PFK可以将更多的果糖分解为中间代谢产物，为下一步反应提供充足的底物，从而产生更多的能量，有利于冬小麦应对低温胁迫。外源SA处理下Dn1中PFK活性均高于Jm22，表明SA显著提高了Dn1在低温胁迫下的能量代谢水平。PK是催化EMP代谢的最后一步反应，其产物丙酮酸是生物体多种循环代谢的底物。已有的研究表明，外源腐胺处理提高了PK和丙酮酸羧化酶的活性，为TCA提供足够的草酰乙酸和丙酮酸，促进了更多ATP的释放[31]。本研究发现，SA处理显著提高了Dn1叶片和分蘖节中PK的活性，显著降低了 -25 ℃时Jm22叶片和分蘖节中PK的活性，导致-25 ℃时丙酮酸产量降低，不能为TCA提供足够的原料，这可能是Jm22抗寒性弱、不能顺利越冬(返青率低)的主要原因。

董文科等[14]发现，低温胁迫可以提高EMP途径中关键酶基因的表达。本研究发现，外源SA处理显著提高了低温胁迫下冬小麦叶片和分蘖节中TaHxK和TaPFK基因的表达量，且对Dn1的作用比Jm22更明显。推测SA通过调节TaHxK和TaPFK基因的表达量来影响这两种酶的活性，从而提高果糖的代谢水平，利于植株维持较高的呼吸代谢。SA处理后，低温胁迫下Dn1中TaPK表达量显著上调，而在Jm22中TaPK下调表达(0 ℃分蘖节除外)，说明SA通过影响基因的表达水平改变相关酶的活性，而基因表达和酶活的不一致，可能由于酶活性的改变不仅发生在mRNA水平，也受到转录调控和细胞代谢的影响。

综上可见，外源SA处理显著提高了Dn1叶片和分蘖节中果糖含量、丙酮酸含量，提高了EMP代谢中HxK、PFK和PK的活性和相关酶基因(TaHxK、TaPFK、TaPK)的表达，这有助于产生更多的有机酸和初级代谢产物，促进呼吸代谢和线粒体电子传递，从而提高Dn1的抗寒性；与Dn1相比，Jm22的EMP代谢相关酶活性及酶基因的表达水平显著低于Dn1，EMP代谢受到了严重的阻遏，不能充分利用前期积累的糖类也不能产生足够的代谢中间物质，导致无法产生足够的越冬所需的能量和小分子物质，这可能也是Jm22无法顺利越冬的原因之一。由此我们得出结论：外源SA可以通过改善冬小麦的EMP代谢途径提高其抗寒性。