潘 雅，黄家军，黄继红，苏炳泽，王海妹，陈赛明

(海南医学院第一附属医院耳鼻咽喉头颈外科，海口 570203)

鼻咽癌是广东等地区的常见恶性肿瘤，多数属于非角化癌，对电离辐射敏感性较高，因此临床上多通过放射治疗进行鼻咽癌的治疗[1]。放射治疗中通过射线造成DNA分子的断裂、交联，直接损伤癌细胞的DNA，同时通过引发瘤体内水分子电离的方式产生对癌细胞DNA分子造成损伤的自由基[2]。鼻咽癌具备辐射剂量依赖型，放射剂量的提高在增加肿瘤局部控制率的同时，也会导致患者出现脑神经麻痹、颞叶坏死等问题，降低患者生存率，因此提高癌细胞放射敏感性是有效控制鼻咽癌的重点内容[3-4]。有学者发现，敲除生殖器形成抑制基因-1(suppressor with morphogenetic effect on genitalia-1，SMG-1)后，癌细胞放射敏感性提高[5]。因此本研究探讨了shRNA靶向干扰SMG-1表达对鼻咽癌细胞放射敏感性的影响。

1 材料与方法

1.1 主要材料

1.1.1实验细胞与动物

稳定转染shRNA-SMG-1有效干扰序列的人源性鼻咽癌CNE-2细胞(西南医科大学)，转染SMG-1无效干扰序列的人源性鼻咽癌CNE-2细胞(西南医科大学)，野生型人源性鼻咽癌CNE-2细胞(南方医科大学)。24只3～4周龄的雌性BALB/c-nu小鼠(成都达硕实验动物有限公司)，于无特定病原体(SPF)级实验动物房内分笼饲养。实验过程严格遵守动物伦理委员会相关规定。

1.1.2仪器与试剂

胎牛血清(FBS)、RPMI改良培养基(美国HyClone公司)；100×青霉素-链霉素溶液、胰酶细胞消化液(上海碧云天生物技术有限公司)；磷酸盐缓冲液(PBS)干粉、二甲基亚砜(DMSO)、苏木素-伊红(HE)染色试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)；细胞凋亡原位检测试剂盒(瑞士Roche公司)。游标卡尺(瑞典医科达公司)；液氮罐、高速离心机、石蜡切片机(四川海盛杰低温科技有限公司)；倒置相差显微镜(日本Olympus公司)；高压灭菌锅、恒温水浴箱(美国PolyScience公司)；流式细胞仪(美国贝克曼库尔特公司)。

1.2 方法

1.2.1实验分组

将实验裸鼠随机分为A组(未放射)、B组(放射)，随后根据接种细胞的不同，将A、B组裸鼠再分别划分为接种稳定转染shRNA-SMG-1有效干扰序列的N-CNE-2SH组、Y-CNE-2SH组，接种转染SMG-1无效干扰序列的N-CNE-2MG组、Y-CNE-2MG组，未经任何处理的野生型鼻咽癌CNE-2细胞的N-CNE-2组、Y-CNE-2组，每组4只。

1.2.2主要溶液配制

pH 7.2～7.4的PBS：于PBS干粉中加双蒸水定容至2 000 mL，分装，灭菌，冷却后4 ℃密封保存。完全培养基：5.0 mL FBS混合0.5 mL青霉素-链霉素溶液，再加入RPMI改良培养基至50.0 mL。冻存液：1.0 mL DMSO中加FBS至10.0 mL，4 ℃预冷保存。

1.2.3人源性鼻咽癌CNE-2细胞处理

37 ℃恒温水浴箱解冻60 s，融化后转移至离心管低速离心(1 000 r/min离心3 min)，弃上清液，加入完全培养基，重悬为单个细胞，接种于培养皿，置于孵箱常温培养(37 ℃、5% CO2)。细胞贴壁生长汇合度达到70%～80%时，弃旧培养基，PBS洗涤2次，加入胰蛋白酶进行消化，半数细胞悬浮时，加入完全培养基终止消化；收集细胞悬浮液，离心管低速离心(1 000 r/min离心3 min)，弃上清液，加完全培养基，一部分重悬传代，一部分加入4 ℃预冷冻存液冻存。冻存管密封，依次按4 ℃ 30 min、-20 ℃ 1 h、-80 ℃过夜处理后，移入液氮罐中。按传代法收集细胞后，加入完全培养基，制成细胞悬液，滴入消毒后的血球计数板中，按“计上不计下，计左不计右，2个及以上粘连细胞团计为1个细胞”的原则进行细胞计数。

1.2.4裸鼠皮下移植瘤模型建立

分别收集处于指数生长期的CNE-2SH细胞、CNE-2MG细胞、CNE-2细胞，PBS洗涤2次，细胞计数后分成2份，一份加入PBS制成浓度为1×107/mL的3种接种液；一份直接接受不同剂量的辐射照射。对裸鼠左右后侧大腿处皮肤消毒后，将CNE-2SH细胞分别接种于N-CNE-2SH组、Y-CNE-2SH组；CNE-2MG细胞分别接种于N-CNE-2MG组、Y-CNE-2MG组；CNE-2细胞分别接种于N-CNE-2组、Y-CNE-2组。接种后第22天Y-CNE-2SH组、Y-CNE-2MG组、Y-CNE-2组采用局部放射治疗，皮源距100 cm，辐射剂量2 Gy/次，剂量率200 cCy/min，治疗频率每天1次，连续5 d。

1.2.5苏木素-伊红(HE)染色

细胞接种后第40天处死全部裸鼠，剥离移植瘤，移植瘤称质量后，进行石蜡包埋，通过HE染色观察移植瘤组织学特点。HE染色中，首先将剥离后的移植瘤切片放置烤箱中以67 ℃烘烤2 h，烘烤后进行二甲苯脱蜡处理，并进行梯度乙醇水合，不同浓度乙醇各处理5 min。然后自来水冲洗病理切片，使用苏木素染液染色，10 min后自来水将多余的染液冲洗，再利用1%盐酸乙醇褪色操作，自来水将其冲洗至蓝色，使用伊红染色1 min。最后采用梯度乙醇脱水，各浓度乙醇脱水5 min，后使用二甲苯处理病理切片，中性橡胶封片，将其置于显微镜下观察移植瘤组织学特点。

1.2.6末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)法

以TUNEL法进行凋亡细胞的原位检测，细胞核染成棕色的细胞即为凋亡细胞。置于显微镜下观察，随机选择5个高倍镜视野，并进行凋亡细胞的计数，取平均凋亡细胞数描述瘤体组织中癌细胞的凋亡情况。

1.2.7四甲基偶氮唑蓝(MTT)

将处于指数生长期的CNE-2SH细胞、CNE-2MG细胞、CNE-2细胞分别接种到96孔板中(5×103个/孔)。孵育过夜后，用不同的放射剂量(0、2、4、6、8 Gy)照射细胞，在37 ℃、5% CO2培养箱中培养。处理细胞48 h后，向96孔板的每个孔中加入10 μL MTT溶液(0.5 mg/mL)。孵育4 h后，倒掉每孔的上清液，并加入100 μL DMSO溶液。最后用微孔板分光光度计检测490 nm处的吸光度。

1.2.8流式细胞术检测细胞凋亡情况

将CNE-2SH细胞、CNE-2MG细胞、CNE-2细胞接种至6孔板中，过夜孵育后，对各组细胞进行放射处理(辐射剂量2 Gy/次，剂量率200 cCy/min)。收集细胞用0.25%胰蛋白酶消化，PBS洗涤2次。加入100 μL结合缓冲液制备成悬浮液(1×106个/mL)。将悬液与Annexin V-FITC和碘化丙啶(PI)结合缓冲液中在室温下避光孵育15 min。使用流式细胞仪检测细胞凋亡,实验重复3次。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 裸鼠移植瘤体积变化

6组裸鼠均形成可持续生长的结节，成瘤率100%。与N-CNE-2组、N-CNE-2MG组比较，N-CNE-2SH组裸鼠移植瘤的瘤体体积减小(t=15.633，P<0.05；t=11.938，P<0.01)；N-CNE-2组与N-CNE-2MG组瘤体体积比较，差异无统计学意义(t=1.324，P=0.243)。N-CNE-2SH组的体积抑瘤率为38.60%。放射后，与Y-CNE-2组、Y-CNE-2MG组比较，Y-CNE-2SH组裸鼠移植瘤的瘤体体积减小(t=16.621，P<0.05；t=17.921，P<0.05)；Y-CNE-2组与Y-CNE-2MG组瘤体体积比较差异无统计学意义(t=1.670，P=0.156)。Y-CNE-2SH组的体积抑瘤率为64.88%。与放射前比较，放射后3组裸鼠的瘤体体积均明显减小(P<0.05)。

2.2 裸鼠移植瘤重量变化

N-CNE-2SH组的瘤体重量明显小于N-CNE-2组、N-CNE-2MG组的瘤体重量(F=5.180，P<0.05)，质量抑瘤率为50.70%。Y-CNE-2SH组的瘤体重量明显小于Y-CNE-2组、Y-CNE-2MG组(F=5.429，P<0.05)，质量抑瘤率为70.65%，见图1、2。Y-CNE-2SH组瘤体重量小于N-CNE-2SH组(P<0.05)。

图1 细胞接种第40天放射各组裸鼠情况

2.3 裸鼠移植瘤HE染色结果

N-CNE-2组、N-CNE-2MG组中裸鼠瘤体组织切片中癌细胞排列紧凑，细胞核偏大，染色较深，并未出现分辨性强的坏死区域；而N-CNE-2SH组裸鼠瘤体组织切片中出现明显灶状坏死区，该区域内存在癌细胞核固缩、破裂现象，且细胞质红染区域增大。Y-CNE-2组、Y-CNE-2MG组裸鼠瘤体组织切片中出现局灶状坏死区，部分区域出现癌细胞核固缩、破裂，细胞质红染区域增大等现象。相比于其他5组，Y-CNE-2-SH组中裸鼠瘤体组织切片内出现大片液化坏死区，处于该区域内的癌细胞核发生固缩、破裂、溶解，且伴随着细胞质出现大片红染区域，见图3。

图2 各组裸鼠移植瘤重量变化

图3 各组裸鼠移植瘤HE染色结果

2.4 裸鼠移植瘤内癌细胞凋亡情况

接种相同癌细胞的前提下，与A组各亚组细胞比较，B组对应各亚组癌细胞凋亡细胞数均呈明显的增加，差异有统计学意义(P<0.05)。N-CNE-2SH组裸鼠癌细胞凋亡细胞数明显多于N-CNE-2组与N-CNE-2MG组(t=3.867、3.557，P=0.031、0.038)。Y-CNE-2SH组裸鼠癌细胞凋亡细胞数明显多于Y-CNE-2组、Y-CNE-2MG组(t=6.223、5.657，P=0.002、0.005)，见图4、5。

图4 各组癌细胞凋亡情况(TUNEL，×400)

2.5 放射各组细胞存活情况

Y-CNE-2组细胞凋亡率为3.5%，明显低于Y-CNE-2MG组的8.0%和Y-CNE-2SH组的12.1%，差异有统计学意义(P<0.05),见图6。

不同剂量辐射下，放射各组存活分数均随着辐射剂量的增大而逐渐降低。Y-CNE-2SH组细胞的存活分数明显少于Y-CNE-2MG组与Y-CNE-2组。随着辐射剂量的增加，Y-CNE-2SH组细胞存活分数下降幅度多于Y-CNE-2MG组与Y-CNE-2组，见图7。

图5 各组裸鼠癌细胞凋亡情况

图6 放射各组流式细胞图

图7 MTT法检测不同放射剂量的放射各组细胞存活曲线

3 讨 论

2018年，全球鼻咽癌发病12.9万例，占全球癌症总发病率的0.7%，我国95%以上鼻咽癌属于非角化癌，对电离辐射具有高度敏感特性[6]。鼻咽癌属于一种剂量依赖型肿瘤，放射剂量的提高对肿瘤局部控制十分有利，但由此易引发患者出现脑神经麻痹、吞咽困难等问题，严重影响患者的生存质量[7]。因此提高鼻咽癌细胞放射敏感性成为控制鼻咽癌的有效手段。射线可通过直接损伤肿瘤细胞DNA进行抗癌治疗，同时放射线还可通过促使瘤体内水分子电离生成自由基，间接作用于DNA分子损伤癌细胞DNA[8-9]。SMG-1为哺乳动物体内PIKK家族成员之一，参与无义介导的mRNA降解(non-sense mRNA decay，NMD)途径，通过该途径降解无义突变产生的含有提前终止密码子的mRNA，防止潜在毒性蛋白的生成[10-11]。相关文献表明，SMG-1参与调控细胞的生长、增殖，且SMG-1基因敲除后，肿瘤细胞的放射敏感性明显提高[12]。

有研究认为通过siRNA技术下调SMG-1表达，可在一定程度上提高癌细胞对放射的敏感度，达到改善患者预后的目的[13]。本研究通过移植瘤瘤体的体积与重量两个指标监测裸鼠移植瘤生长情况，Y-CNE-2SH组裸鼠移植瘤瘤体体积减小幅度大于Y-CNE-2MG组、Y-CNE-2组，Y-CNE-2SH组的体积抑瘤率为64.88%。N-CNE-2SH组的移植瘤瘤体重量明显小于N-CNE-2组、N-CNE-2MG组，重量抑瘤率为50.70%；Y-CNE-2SH组的瘤体重量明显小于Y-CNE-2组、Y-CNE-2MG组，重量抑瘤率为70.65%；Y-CNE-2MG组瘤体重量明显小于N-CNE-2SH组。说明接种CNE-2SH细胞的裸鼠移植瘤细胞的放射敏感性强于接种CNE-2MG细胞、CNE-2细胞的放射敏感性。

根据已有文献可知，显微镜下鼻咽癌癌细胞分布呈巢状、排列紊乱，细胞大小、形态不同，细胞核体积大，且存在核分裂不一现象，细胞异型性明显等组织学特点[14-15]。HE染色结果显示N-CNE-2组、N-CNE-2MG组中癌细胞排列紧凑，并未出现分辨性强的坏死区域；N-CNE-2SH组中癌细胞核固缩、破裂，有明显灶状坏死区。Y-CNE-2组、Y-CNE-2MG组部分区域出现癌细胞核固缩、破裂，有局灶状坏死区出现；Y-CNE-2SH组中出现大片液化坏死区，癌细胞核发生固缩、破裂、溶解，细胞质出现大片红染区域。从凋亡细胞数上分析，B组各亚组的癌细胞凋亡数高于A组对应亚组；Y-CNE-2SH组癌细胞凋亡数多于Y-CNE-2组、Y-CNE-2MG组；N-CNE-2SH组癌细胞凋亡数多于N-CNE-2组、N-CNE-2MG组。流式细胞仪检测结果显示同一剂量辐射下，Y-CNE-2SH组(12.1%)细胞的凋亡率明显高于Y-CNE-2组(3.5%)、Y-CNE-2MG组(8.0%)。结合文献可知，shRNA靶向干扰SMG-1表达有利于鼻咽癌癌细胞的控制，同时通过促进瘤体细胞凋亡的方式提高癌细胞放射敏感性。

综上所述，shRNA靶向干扰SMG-1表达可在一定程度上抑制鼻咽癌CNE-2细胞瘤体的生长，提高瘤体细胞凋亡率；shRNA靶向干扰SMG-1表达联合放疗对瘤体生长抑制作用更为明显，同时具备更有效的促癌细胞凋亡作用，即shRNA靶向干扰SMG-1表达可提高鼻咽癌细胞放射敏感性。