刘子瑄，孔馨逸，陈璐，江大海

(1.西京学院 医学院，西安 710123；2.陕西省农产品质量安全中心，西安 710016；3.陕西中医药大学附属医院，陕西 咸阳 712000)

汉麻属中的火麻仁成熟的果实是著名的药食同源的保健食品,主要分布于我国广西西部、云南南部、新疆等地[1-2]。汉麻籽油是能够溶解于水中的油料，在所有的植物中，其不饱和脂肪酸的含量较高，是目前发现的较为有效的抗衰老和抗辐射的油脂[3]；汉麻籽中含有丰富的蛋白质和人体必需的氨基酸，可以用于食品和保健[4]。

汉麻主要用于纺织业、药物和食物3个方面，汉麻的皮含有丰富的纤维，是制作衣服或者其他布料加工的材料，汉麻籽含有人体所需的各种氨基酸，常被加工成为汉麻相关的产品[5]。

汉麻叶中也含有丰富的黄酮类化合物，黄酮类成分具有抗炎、抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、保护内脏等多种生物功效，是食品和功能性调味品的重要生产材料[6-7]。从汉麻叶中提取黄酮成分不仅可以拓展黄酮的来源，同时也能提升汉麻产品的附加值，有利于汉麻产业链的资源综合利用[8]。目前，黄酮类化合物提取工艺主要有溶剂提取法、微波辅助提取法、超声波辅助提取法、酶解法、双水相萃取法和超临界流体萃取法[9-10]。本试验主要利用溶剂提取法对汉麻叶中的黄酮提取工艺进行研究，同时对汉麻叶中黄酮的抗氧化活性进行研究，旨在为汉麻叶中黄酮提取工艺获取最适提取条件[11]。

1 材料与方法

1.1 试验材料和试剂

汉麻叶、氢氧化钠、无水乙醇、硫酸、葡萄糖、氯化钠、水杨酸、碳酸钠、盐酸、维生素C和磷酸氢二钾。

1.2 试验设备

恒温水浴锅、冷冻干燥机、电子天平、分析天平、紫外分光光度计、pH计和粉碎机。

1.3 试验方法

1.3.1 黄酮得率的计算

芦丁标准曲线的绘制：称取干燥的芦丁10 mg，使用浓度为60%的乙醇定容至50 mL。取0，1，2，3，4，5 mL的芦丁标准液于10 mL的比色管中，依次加入5%的亚硝酸钠0.3 mL，混匀，放置5 min，之后加入浓度为10%的硝酸铝，混匀，静置10 min，以不含芦丁的比色管的溶液为参数，在吸光度为510 nm的条件下测定吸光度[12-13]，计算并得到吸光度的回归方程：Y(吸光度)=10.345X+0.0156(R2=0.9906；X为芦丁浓度)。

汉麻叶中黄酮得率(%)=[(Y+0.0124)×V×10]/[10.235×M×1000]×100%。

式中：Y为样品的吸光值，V为反应的体积，M为汉麻叶粉末的质量。

1.3.2 汉麻叶黄酮提取单因素试验

样品的预处理：将药物经粉碎机粉碎过80目筛，获得汉麻叶粉末，称取汉麻叶粉末100 g，加入200 mL 95%的乙醇进行脱脂，在70 ℃的水浴中搅拌2 h，4000 r/min离心15 min后进行脱脂，过滤并烘干备用。

将精密处理后的汉麻叶粉1 g，乙醇浓度60%、提取时间80 min、提取温度60 ℃、汉麻叶与溶剂的比例1∶30 (g/mL)作为单因素试验的基础条件。当某一个因素改变时，其他因素保持不变。在乙醇浓度分别为40%、50%、60%、70%、80%和90%；提取时间分别为20，40，60，80，100，120，140 min；提取温度分别为30，40，50，60，70，80，90 ℃；料液比分别为1∶20、1∶25、1∶30、1∶5、1∶40；提取次数分别为1，2，3，4，5的条件下，按照上述方法进行单因素试验。

1.3.3 响应面分析试验设计

根据单因素试验，以提取时间、料液比、提取次数和提取温度作为变量因素，以汉麻叶黄酮的得率作为目标，采用四因素三水平的响应面分析，优化汉麻叶黄酮的提取工艺，获得最佳提取工艺参数。

响应面因素和水平设计见表1。

表1 响应面试验因素和水平设计Table 1 Design of response surface test factors and levels

2 结果与分析

2.1 乙醇体积分数对黄酮提取得率的影响

由图1可知，随着乙醇体积分数的增大，汉麻叶中的黄酮得率呈现先升高后降低的趋势。当乙醇体积分数达到60%时，汉麻叶中的黄酮得率达到最高，为2.0%。当乙醇体积分数小于60%时，汉麻叶中的黄酮得率随着乙醇体积分数的升高而升高；当乙醇体积分数大于60%时，汉麻叶中的黄酮得率随着乙醇体积分数的升高而降低。乙醇的极性低于水的极性，当乙醇体积分数低于60%时，随着乙醇体积分数的不断升高，提取液的极性开始与黄酮的极性相接近，所以，黄酮的提取率越来越高；当乙醇的体积分数高于60%时，提取液的极性与黄酮的极性相差越来越大，导致溶液中黄酮提取率开始降低。所以，确定乙醇体积分数为60%作为最佳的提取条件。

图1 乙醇体积分数对黄酮提取得率的影响Fig.1 The effect of ethanol volume fraction on the extraction yield of flavonoids

2.2 提取时间对黄酮提取得率的影响

由图2可知，随着提取时间的增长，汉麻叶中黄酮提取得率先升高后降低，在80 min时黄酮的得率达到最高，为2.0%。当提取时间小于80 min时，汉麻叶中黄酮的得率随着提取时间的延长而升高；提取时间大于80 min时，汉麻叶中黄酮的得率随着时间的延长而降低。这是由于当时间小于80 min时，汉麻叶中的黄酮浓度很低，所以随着时间的延长，提取液中黄酮的得率随着时间的增长而升高，当提取时间超过80 min时，提取液中的黄酮浓度已经达到饱和，随着提取时间的增长，汉麻叶中的其他物质溶入提取液中，导致黄酮提取量降低。所以，本试验选取提取时间80 min作为最佳的提取条件。

图2 提取时间对黄酮提取得率的影响Fig.2 The effect of extraction time on the extraction yield of flavonoids

2.3 提取温度对黄酮提取得率的影响

由图3可知，当提取温度为30～60 ℃时，汉麻叶中黄酮的得率随着提取温度的升高而升高，当提取温度达到60 ℃时，黄酮的得率最高，为2.0%。当温度超过60 ℃时，汉麻叶中黄酮的得率随着提取温度的升高而降低。随着汉麻叶黄酮提取温度的升高，汉麻叶中黄酮的溶解度、扩散度和传质速度都有所增加。当温度超过60 ℃时，黄酮中含有大量的羟基，极易被氧化，从而导致汉麻叶中黄酮提取量降低。因此，该试验选择60 ℃作为最佳提取温度。

图3 提取温度对黄酮提取得率的影响Fig.3 The effect of extraction temperature on the extraction yield of flavonoids

2.4 料液比对黄酮提取得率的影响

由图4可知，随着料液比的增加，汉麻叶中黄酮得率先升高后降低。当料液比为1∶30时，黄酮得率最高，为2.0%。当料液比小于1∶30时，黄酮得率随着料液比的增加而升高；当料液比大于1∶30时，汉麻叶中的黄酮得率随着料液比的增加而降低。这是由于当料液比小于1∶30时，料液比逐渐增大，动态反应逐渐向产生黄酮的方向移动，造成黄酮的量逐渐增多，随着料液比的增大，汉麻叶中的其他物质也逐渐溶解出来，从而影响汉麻叶中黄酮的获得。所以，本研究选取料液比1∶30作为最佳的料液比。

图4 料液比对黄酮提取得率的影响Fig.4 The effect of solid-liquid ratio on the extraction yield of flavonoids

2.5 提取次数对黄酮提取得率的影响

由图5可知，随着提取次数的增加，汉麻叶中黄酮得率也随之增加。但是经过2次提取之后，继续增加黄酮的提取次数，黄酮的得率增加却不明显，故选择提取2次作为最佳的提取次数，这样不仅能够保证黄酮相对较高的得率，同时也能避免重复试验造成人力、物力资源的浪费。

图5 提取次数对黄酮提取得率的影响Fig.5 The effect of extraction times on the extraction yield of flavonoids

2.6 响应面法优化汉麻叶黄酮提取工艺

2.6.1 响应面法分析的方案和结果

在单因素试验的基础上，通过BBD原理的设计，该试验以A提取时间、B料液比、C提取次数、D提取温度为影响因素，将汉麻叶的黄酮得率作为响应值，进行三水平试验，试验结果见表2。

表2 响应面试验设计及结果Table 2 Response surface test design and results

2.6.2 响应模型的建立及显著性检验

使用软件Design-Expert 8.0对表3中的试验数据进行多元线性分析和二项式的拟合分析，得到汉麻叶黄酮得率对自变量二项式中的回归方程：Y=2.88+0.32A+0.22B+0.32C+0.24D+0.054AB-0.12AC+0.086AD-0.16BC+0.054BD+0.21CD-0.12A2-0.16B2-0.22C2-0.14D2。

由表3可知，一次项结果A、B、C和D与二次项结果A2、B2、C2和D2对汉麻中黄酮提取的影响极显著(P<0.01)，交叉项AC和BC对汉麻叶中的黄酮影响显著(P<0.05)，由方差分析结果可知，二次回归方程的模型小于0.01，失拟项不显著(P=0.3802)，模型相关系数R2=0.9828，这些数据表明回归方程拟合性好，数学模型稳定，试验结果能够被很好地描述。

表3 响应面二次方程的方差及分析结果Table 3 The variance and analysis results of the quadratic equation of response surface

通过分析，响应面优化工艺的最佳提取工艺为料液比1∶28，提取时间95 min、提取温度62 ℃、提取次数2次。

2.7 汉麻叶黄酮抗氧化活性研究

由图6可知，汉麻叶黄酮对羟基自由基的清除率较强，且随着汉麻叶黄酮浓度的增加，其羟基自由基的清除能力也逐渐增强。当浓度达到1 mg/mL时，汉麻叶黄酮对羟基自由基的清除率最高，为89%。

图6 黄酮和Vc对羟基自由基的清除率Fig.6 The scavenging rates of flavonoids and Vc on hydroxyl radicals

3 结论

随着社会的发展，汉麻相关的产品逐渐受到全世界人民的重视，汉麻不仅可以作为工业原料开发工业纤维，而且可以用于提取汉麻叶黄酮，应用于临床治疗癌症、神经类疾病，最大限度完善汉麻产业链。

本试验通过中心组合设计响应面法，以料液比、提取时间、提取温度和提取次数为影响因素，以提取黄酮的总量为响应值，得到汉麻叶提取的最佳工艺：料液比为1∶28，提取时间为95 min，提取温度为62 ℃和提取次数为2次。在此条件下，研究汉麻叶黄酮与维生素C的抗氧化活性，研究结果表明，汉麻叶黄酮具有明显的抗氧化活性。