王莹，曾祥辉，邓慧，王瑛，杨梦男

(邵阳学院 食品与化学工程学院，湖南 邵阳 422000)

油脂在贮存过程中容易发生氧化变质，其主要原因是油脂本身由大量不饱和脂肪酸构成[1]，当长时间贮藏时，受外界因素及微生物影响，极易氧化生成氢过氧化物，进一步分解产生许多构成油脂异味的不良成分[2-4]。油脂氧化变质不仅会造成味道、色泽、品质的下降，而且严重威胁了人体健康[5-6]。长期以来，人们习惯于在油脂中加入人工合成抗氧化剂来抑制氧化反应进行保鲜，但随着人工合成抗氧化剂的缺点越来越明显，选择天然抗氧化剂在油脂中的应用已成为一种趋势[7-8]。

迷迭香是一种高效的天然抗氧化剂，在迷迭香提取物中，二萜类化合物是发挥抗氧化作用的主要物质，其高活性抗氧化成分鼠尾草酸、鼠尾草酚在防止油脂氧化方面具有显著效果，可有效抑制细菌的生理活性，起到抑菌防腐的作用[9-10]，促进油脂在防腐保鲜及抗氧化方面的发展[11-12]。国内外均研究发现，添加迷迭香提取物能够有效抑制食用植物油脂和动物油脂在加工储藏过程中的氧化作用，从而延长产品的保质期[13-15]。本研究不使用化学试剂，对以食用油为提取剂提取得到的迷迭香脂溶性抗氧化剂进行体外抗氧化活性研究，再将提取液加入到食用油中分析其抗氧化性能，提供一种全新的天然抗氧化剂，解决食用油在加工运输和储藏过程中发生氧化酸败变质的问题。

1 试验材料与方法

1.1 试验材料

迷迭香叶；食用油：邵阳市纯香榨油坊；2,2-联氨基-双-二铵盐、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼：纯度≥97%，上海如吉生物科技有限公司；2,6-二叔丁基对甲酚(BHT)、特丁基对苯二酚(TBHQ)等：食品级；冰乙酸、三氯甲烷、碘化钾、过硫酸钾、磷酸二氢钠、硫代硫酸钠、三氯化铁、三氯乙酸等：分析纯。

1.2 仪器与设备

DK-98-II电热恒温水浴锅、202-0A电热恒温干燥箱 天津市泰斯特仪器有限公司；VELOCITY 14R离心机 Dynamica Scientific Ltd.；SCIENTZ-18N冷冻干燥机 宁波新芝生物科技股份有限公司；UV-1780紫外可见分光光度计 日本岛津公司。

1.3 试验方法

1.3.1 迷迭香提取液的制备与处理

准确称取一定量使用水蒸气蒸馏法去精油的迷迭香粉末于锥形瓶中，以食用油为提取剂[16-17]，选取最优提取条件，采用恒温水浴浸提法进行提取，离心过滤后得迷迭香脂溶性抗氧化剂提取液，分别进行乙腈萃取旋蒸冻干后的体外抗氧化活性测定与将迷迭香脂溶性抗氧化剂提取液加入食用油中的油脂抗氧化试验。

1.3.2 DPPH自由基清除率测定

参考Chen等[18]的方法并稍作改动，取不同浓度梯度(0，0.02，0.04，0.08，0.16，0.32，0.64 mg/mL)的迷迭香样品溶液2.0 mL，加入2.0 mL 0.135 mmol/L的DPPH工作液，混合均匀，于室温条件下避光反应30 min。以溶剂校零，测定其在517 nm处的吸光度。

消除率(%)=[1-(AS-AB)/A0]×100%。

式中：AS为样品反应组的吸光度值；AB为阴性对照组的吸光度值；A0为空白对照组测定的吸光度值，下式同。

1.3.3 ABTS自由基清除率测定

取不同浓度梯度(0，0.02，0.04，0.08，0.16，0.32，0.64 mg/mL)的迷迭香样品溶液2.0 mL，参考Re等[19]的方法并稍作改动，加入2.0 mL(在734 nm处吸光度值为0.7±0.02)的ABTS工作液，混合均匀，于室温条件下避光反应30 min。以无水乙醇或去离子水校零，测定其在734 nm处的吸光度，同时按照相同的方法作空白对照以及阴性对照。

消除率(%)=[1-(AS-AB)/A0]×100%。

1.3.4 OH自由基清除率测定

参考Liu等[20]的方法，取(0，0.02，0.04，0.08，0.16，0.32，0.64 mg/mL)的迷迭香样品溶液1.0 mL，先加入1.0 mL的FeSO4溶液，再依次加入1.0 mL的水杨酸溶液和1.0 mL的H2O2溶液，置于37 ℃的水浴锅中反应30 min，测定其在510 nm处的吸光度。

消除率(%)=[1-(AS-AB)/A0]×100%。

1.3.5 Fe3+还原力测定

参考杨明非等[21]的方法并稍作修改，取(0，0.02，0.04，0.08，0.16，0.32，0.64 mg/mL)的迷迭香样品溶液1.0 mL，依次向反应体系中加入2.5 mL的磷酸盐缓冲液与铁氰化钾溶液，混合均匀后置于50 ℃水浴锅中反应20 min，再加入2.5 mL三氯乙酸溶液进行终止反应，于5000 r/min条件下离心10 min，吸取上清液2.5 mL，按顺序加入2.5 mL蒸馏水与0.5 mL三氯化铁溶液，充分摇匀，室温条件下反应10 min，在700 nm处进行吸光度的测定。

吸光度值=AS-A0。

1.3.6 油脂抗氧化试验

采用Schaal烘箱法，按GB 2760-2014标准添加不同的抗氧化剂，混合均匀，同时以不添加任何抗氧化剂的油样作空白，将所有试样敞口放置于(60±1) ℃电热恒温干燥箱中强化保存，并交换其位置，每隔3 d分别取平行样，参考GB 5009.227-2016《食品安全国家标准 食品中过氧化值的测定》测定食用油的过氧化值，分析迷迭香脂溶性抗氧化剂的抗氧化性能。

2 试验结果与分析

2.1 迷迭香脂溶性抗氧化剂体外抗氧化活性

2.1.1 清除DPPH自由基能力

由图1可知，在所测定的质量浓度范围内，采用不同食用油提取的迷迭香脂溶性抗氧化剂对DPPH自由基的清除率均呈现出明显的量效关系，清除率随着质量浓度的增大而增强。经计算可以得出，采用大豆油、花生油、芝麻油、菜籽油和葵花籽油为提取剂,提取得到的迷迭香脂溶性抗氧化剂清除DPPH自由基的半数抑制浓度分别为0.103，0.044，0.032，0.037，0.033 mg/mL，采用芝麻油提取的迷迭香脂溶性抗氧化剂对DPPH自由基的清除能力略高于同质量浓度的花生油、菜籽油、葵花籽油提取剂，明显高于同质量浓度的大豆油提取剂。

图1 迷迭香脂溶性抗氧化剂对DPPH自由基的清除作用Fig.1 The scavenging effect of rosemary fat-soluble antioxidants on DPPH radicals

2.1.2 清除OH自由基能力

由图2可知，采用不同食用油提取的迷迭香脂溶性抗氧化剂对OH自由基具有一定的清除能力，在0.02～0.64 mg/mL的质量浓度范围内，由5种食用油提取得到的迷迭香脂溶性抗氧化剂的OH自由基清除率随着质量浓度的增大而增强。经计算得出由大豆油、花生油、芝麻油、菜籽油、葵花籽油提取得到的迷迭香脂溶性抗氧化剂清除OH自由基的IC50值分别为0.551，0.595，0.453，0.265，0.638 mg/mL，在相同质量浓度下，菜籽油提取得到的迷迭香脂溶性抗氧化剂对OH自由基的清除能力最高。虽然整体迷迭香脂溶性抗氧化剂对OH自由基清除活性不高，但依旧具有有效清除的能力，可作为天然抗氧化剂应用。

图2 迷迭香脂溶性抗氧化剂对OH自由基的清除作用Fig.2 The scavenging effect of rosemary fat-soluble antioxidants on OH radicals

2.1.3 清除ABTS自由基能力

由图3可知，采用5种食用油提取的迷迭香脂溶性抗氧化剂对ABTS自由基都具有较强的清除效果，ABTS自由基清除率随着样品质量浓度的增大而增强，在0.02～0.08 mg/mL的质量浓度范围内增幅极显著。其中，以大豆油、花生油、芝麻油、菜籽油和葵花籽油为提取剂提取得到的迷迭香脂溶性抗氧化剂清除ABTS自由基的IC50值分别为0.261，0.123，0.060，0.097，0.203 mg/mL，芝麻油提取得到的迷迭香脂溶性抗氧化剂对ABTS自由基的清除作用最好，当质量浓度为0.04 mg/mL时，ABTS自由基清除率为31.21%，当质量浓度为0.08 mg/mL时，ABTS自由基清除率达到69.65%，具有较强的体外抗氧化活性能力。

图3 迷迭香脂溶性抗氧化剂对ABTS自由基的清除作用Fig.3 The scavenging effect of rosemary fat-soluble antioxidants on ABTS radicals

2.1.4 Fe3+还原力

Fe3+还原力是抗氧化物质提供电子能力强弱的重要指标，自由基通过抗氧化物质提供的电子而失活，通常情况下，抗氧化活性与抗氧化物质的还原能力有显著的相关性，测定的吸光度值越大，还原能力越强，样品的抗氧化活性也越强[22]。

由图4可知，样品在700 nm处的吸光度值与其质量浓度呈正相关性，Fe3+还原力随着迷迭香脂溶性抗氧化剂质量浓度的增大而增强。在相同的质量浓度下，采用葵花籽油提取的迷迭香脂溶性抗氧化剂的Fe3+还原力>芝麻油>菜籽油>花生油>大豆油。由此表明，迷迭香脂溶性抗氧化剂具有一定的Fe3+还原能力，且葵花籽油提取的效果最佳。

图4 迷迭香脂溶性抗氧化剂对Fe3+的还原力Fig.4 Reducing power of rosemary fat-soluble antioxidants to Fe3+

2.2 迷迭香脂溶性抗氧化剂抑制食用油氧化效果

2.2.1 大豆油

由图5可知，添加迷迭香提取液及迷迭香提取液与Vc复配的大豆油样过氧化值随诱导时间的延长而缓慢上升，抗氧化能力强于BHT、TBHQ化学合成抗氧化剂，从第12天开始，两组油样之间增幅变大，与Vc复配后的迷迭香提取液抗氧化能力有所增强，说明迷迭香提取液与Vc复配对大豆油具有协同增效的作用。

图5 抗氧化剂对大豆油的抗氧化作用Fig.5 Antioxidant effect of antioxidants on soybean oil

2.2.2 花生油

由图6可知，对比空白对照组，4种抗氧化剂添加到花生油中均起到较好的抗氧化作用，延缓了花生油的氧化，相比较而言，添加迷迭香提取液的油样过氧化值总体低于加入化学合成抗氧化剂BHT与TBHQ的，对花生油的抗氧化作用由大到小为：迷迭香提取液+Vc>迷迭香提取液>TBHQ>BHT。

图6 抗氧化剂对花生油的抗氧化作用Fig.6 Antioxidant effect of antioxidants on peanut oil

2.2.3 芝麻油

由图7可知，除空白对照组外，其余添加了抗氧化剂的4组油样过氧化值增幅缓慢并且差距不大，均明显小于空白对照组。在高温加速氧化过程中，芝麻油中含有大量的不饱和脂肪酸，本应易氧化，但空白对照组过氧化值整体增幅比其他食用油小，这是由于芝麻油中含有木脂素类化合物和生育酚类物质。

图7 抗氧化剂对芝麻油的抗氧化作用Fig.7 Antioxidant effect of antioxidants on sesame oil

2.2.4 菜籽油

由图8可知，添加BHT、TBHQ、迷迭香提取液和迷迭香提取液+Vc的油样，过氧化值随着时间的延长而缓慢增长，在6 d之前，各组之间过氧化值差距不大，远小于空白对照组，诱导时间大于6 d后，4组油样之间增幅出现差异，其中，添加了迷迭香提取液+Vc组的菜籽油样表现出最好的抗氧化效果。

图8 抗氧化剂对菜籽油的抗氧化作用Fig.8 Antioxidant effect of antioxidants on rapeseed oil

2.2.5 葵花籽油

由图9可知，在烘箱法处理中，5组油样的过氧化值随着氧化时间的延长而增加，试验组的葵花籽油过氧化值均低于空白对照组，在一定程度上提高了葵花籽油的氧化稳定性，其中，添加了迷迭香提取液的葵花籽油氧化速率较平缓，迷迭香提取液+Vc复配的油样组在氧化15 d后过氧化值还未达到20 meq/kg，具有很强的抗氧化能力。

图9 抗氧化剂对葵花籽油的抗氧化作用Fig.9 Antioxidant effect of antioxidants on sunflower seed oil

综上可知，添加了抗氧化剂的5种食用油的过氧化值始终小于空白对照组，这表明使用人工合成抗氧化剂BHT、TBHQ与迷迭香脂溶性抗氧化剂提取液，以及迷迭香脂溶性抗氧化剂提取液与Vc复配均可延缓食用油的氧化，但抗氧化性能强弱不一。由图5和图9可知，4种抗氧化剂加入多不饱和脂肪酸油(大豆油、葵花籽油)的过氧化值随时间的变化趋势大致相同，从第3天开始，加入抗氧化剂的食用油与空白对照组的抗氧化能力开始产生差别，随着时间的延长，迷迭香脂溶性抗氧化剂提取液在食用油中表现出明显的优势，同时，抗氧化能力大小在这两种油中有着相同的顺序，依次为迷迭香提取液+Vc>迷迭香提取液>TBHQ>BHT；由图7和图8可知，4种抗氧化剂在单不饱和脂肪酸油(菜籽油)和油酸、亚油酸基本各占50%的芝麻油中没有明显的抗氧化作用差异，迷迭香脂溶性抗氧化剂提取液与Vc复配效果略强于其他3类抗氧化剂；由图6可知，在单不饱和脂肪酸(花生油)中，迷迭香提取液同样表现出明显的优势。这是由于多不饱和脂肪酸不稳定，在加速贮藏过程中极易发生氧化变质，另外，其自身内源性抗氧化成分对食用植物油的氧化稳定性也会产生一定程度的影响[23]。由此可见，迷迭香脂溶性抗氧化剂属于一类具有较强抗氧化性能的物质，可进行深度开发。

3 结论

本研究对以食用油为提取剂提取得到的迷迭香脂溶性抗氧化剂进行体外抗氧化活性测定，并采用Schaal烘箱法研究迷迭香脂溶性抗氧化剂与其他不同抗氧化剂对食用油的油脂抗氧化作用。结果表明，在样品质量浓度范围内，迷迭香脂溶性抗氧化剂的Fe3+还原能力、清除DPPH、ABTS、OH自由基能力均随着质量浓度的增大而增强，综合比较可知，采用芝麻油提取的迷迭香脂溶性抗氧化剂表现出较好的抗氧化活性，其对DPPH、ABTS、OH自由基的IC50值分别为0.032，0.060，0.453 mg/mL；经15 d的诱导氧化，迷迭香脂溶性抗氧化剂对食用油的氧化稳定性呈现出较强的保护作用，在多不饱和脂肪酸油中的抗氧化效果更明显，显著优于化学合成抗氧化剂，且其与Vc的二元复配效果更佳。经初步判断，采用食用油提取的迷迭香脂溶性抗氧化剂可有效延缓食用油腐败变质并延长食用油的保质期。