洪奕，夏海华，田洁萍，张淑梅，于冲，田缘，闫更轩，潘钰*

(1.东北农业大学 资源与环境学院，哈尔滨 150006；2.黑龙江省科学院微生物研究所，哈尔滨 150010)

纳豆激酶(nattokinase，NK)是一种具有高效溶栓作用的丝氨酸蛋白酶，具有被开发成高效纤溶药物或保健食品的潜力，闫泉香等[1]研究发现纳豆激酶在体内外均表现出强大的溶栓活性，且对新旧形成的血栓均有作用。传统工业上产纳豆激酶的方法多是以大豆为原料进行固体或液体发酵，固体发酵可采用的物料比较多，降低成本的同时还可以减少环境污染[2-3]。豆粕是大豆加工制油过程中产生的副产品，营养物质丰富，目前豆粕主要应用在动物饲料方面[4]，若能利用成本较低的豆粕发酵生产出具有高附加值的生物产品，既能降低产纳豆激酶的发酵成本，又能提高豆粕的利用率和价值。孙岩等[5]以豆粕为唯一培养基成分，利用正交试验优化了固态发酵条件，比采用大豆为培养基获得的酶活力高50%左右。

本研究以前期实验室筛选的高产纳豆激酶枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)SWS01为发酵菌种，以豆粕为培养基，采用固体发酵方法产NK，通过单因素试验探究初始含水量、接种量、干豆粕装量、发酵温度、发酵时间和pH值对NK酶活的影响，再利用响应面法[6-7]探究最佳发酵工艺，以期获得较高酶活力的NK，为进一步利用豆粕进行固体发酵工业化生产纳豆激酶奠定了基础。

1 材料和方法

1.1 材料

枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)SWS01：实验室从日本纳豆中筛选获得；豆粕：鹤岗市善成食品有限公司。

1.2 试剂

牛肉浸膏、蛋白胨、蔗糖、氯化钠、琼脂等：哈尔滨市南岗区艾默尔生物技术耗材经销部；尿激酶：中国食品药品检定研究院；牛纤维蛋白原、凝血酶、琼脂糖：Sigma公司。

1.3 主要仪器与设备

ZQLY-300V振荡培养箱 上海知楚仪器有限公司；Olympus-CH显微镜 日本奥林巴斯株式会社；JE203GE电子天平、FE28 pH计 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；CCL-170B -8二氧化碳培养箱 新加坡艺思高科技有限公司；PURA22电热恒温水浴箱 瑞轩电子科技(上海)有限公司；Spectrum SP-1920紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；ZHJH-C1115C超净工作台 北京中仪友信科技有限公司。

1.4 方法

1.4.1 种子液制备

菌种活化：将枯草芽孢杆菌菌株接至斜面培养基培养，37 ℃，24 h，进行菌种活化，挑取1环活化好的的菌株接入50 mL液体培养基中，37 ℃，180 r/min，振荡培养14～18 h，镜检确认无杂菌后可用于固体发酵，此为固体发酵种子液。

1.4.2 固体发酵

250 mL三角瓶中分装一定量的豆粕，封口，灭菌，无菌操作接入相应体积种子液，封口并摇匀，置于无菌恒温培养箱中进行固体发酵，37 ℃发酵24 h，期间或发酵结束取样并测定NK酶活。

1.4.3 NK酶活的测定

发酵结束后，每克固体发酵成熟物加入5 mL 0.9%生理盐水，4 ℃摇床浸提4 h后以4500 r/min的转速离心15 min，上清液即为固体发酵粗酶溶液；采用纤维蛋白平板法[8]测定纳豆激酶活性，采用电子游标卡尺测定溶解圈直径。配制不同浓度的尿激酶溶液(20～100 U/mL)，以尿激酶溶解圈面积为横坐标、NK酶活为纵坐标，绘制标准曲线。测定样品酶活时用溶解圈直径测量值代入回归方程即可求得NK酶活大小。

1.4.4 发酵工艺优化单因素试验

在其他基本发酵条件固定的情况下，依次选取基质初始含水量(25%、35%、45%、55%、65%、75%、85%)、接种量(3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%)、豆粕装量(50，60，70，80，90，100，110 g/250 mL)、发酵温度(25，30，35，40，45，50 ℃)、发酵时间(3～48 h，每隔3 h测定NK酶活)、初始pH值(3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0)，考察其对NK活性的影响。

1.4.5 发酵工艺优化响应面试验

在单因素试验的基础上，选出影响NK酶活的显著性因素进行响应面设计，以NK酶活(Y)为响应值，以接种量(A)、发酵温度(B)、发酵时间(C)3个因素为自变量，应用Design-Expert设计模型，进行三因素三水平Box-Behnken响应面试验，试验因素与水平见表1。

表1 枯草芽孢杆菌SWS01利用豆粕发酵条件优化Box-Behnken响应面试验因素及水平Table 1 Optimization of Box-Behnken response surface test factors and levels by Bacillus subtilis SWS01 using soybean meal fermentation conditions

1.4.6 试验数据统计

所有试验数据取3次重复试验的平均值同时计算标准误差。用GraphPad Prism进行单因素方差分析并作图，响应面结果利用Design Expert 8.0.6进行分析。

2 结果与分析

2.1 尿激酶标准曲线

经游标卡尺测得并计算尿激酶标准品溶液(20, 40, 60, 80, 100 U/mL)的牛纤维蛋白溶解圈面积依次为223.2, 271.22, 319.98, 362.72, 410.98 mm2，孵育结果见图1。

图1 尿激酶标准品和样品溶解圈Fig.1 The dissolving circles of urokinase standard samples and samples

以纤维蛋白溶解圈面积为横坐标、尿激酶酶活为纵坐标，绘制尿激酶标准曲线，见图2。

图2 尿激酶标准曲线Fig.2 Urokinase standard curve

2.2 单因素试验结果

2.2.1 基质初始含水量对产酶的影响

以干豆粕90 g/250 mL、接种量6%、pH自然为初始培养条件，35 ℃发酵24 h，考察培养基基质初始含水量分别为25%、35%、45%、55%、65%、75%、85%时的NK酶活，结果见图3。

图3 初始含水量对产酶的影响Fig.3 Effect of initial water content on enzyme production

基质含水量是固体发酵中的一个重要影响因素，基质含水量小，菌体会在发酵后期由于水分蒸发变干燥而难以生长，造成产酶下降；基质含水量大，菌体生长会受产生的液膜影响，同时易染菌，不利于次级代谢物的产生。由图3可知，随着基质含水量的增大，NK酶活呈现先上升后下降的趋势，在初始含水量为55%时NK酶活性最大，为豆粕在室温下自然浸泡至饱和状态下的百分含量。

2.2.2 接种量对产酶的影响

以干豆粕90 g/250 mL、基质初始含水量55%、pH自然为初始培养条件，35 ℃发酵24 h，考察接种量分别为3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%时的NK酶活，结果见图4。

图4 接种量对产酶的影响Fig.4 Effect of inoculation amount on enzyme production

由图4可知，随着接种量在3%～10%范围内增加，菌株固体发酵产NK酶活的量也随之呈现先升高后降低的趋势，当接种量为5%～6%时，NK酶活增加较明显，而当接种量大于6%时，NK酶活开始下降。因为加入的是种子液，过多加入液体会造成基质水分含量增加，不利于固体发酵过程中的传质和传热，故最佳接种量为6%。

2.2.3 豆粕装量对产酶的影响

以接种量6%、基质初始含水量55%、pH自然为初始培养条件，35 ℃发酵24 h，考察豆粕装量分别为50，60，70，80，90，100，110 g/250 mL时的NK酶活，结果见图5。

图5 豆粕装量对产酶的影响Fig.5 Effect of soybean meal loading volume on enzyme production

固体发酵过程中豆粕装量直接影响基质中氧的含量，装量过少，菌体营养不够，产酶活性低；装量过大，豆粕会非常黏稠，也不利于产酶。由图5可知，豆粕装量为90 g/250 mL时NK酶活最大。

2.2.4 发酵温度对产酶的影响

以干豆粕90 g/250 mL、基质初始含水量55%、接种量6%、pH自然为初始培养条件，固体发酵24 h，考察发酵温度分别为25，30，35，40，45，50 ℃时的NK酶活，结果见图6。

图6 发酵温度对产酶的影响Fig.6 Effect of fermentation temperature on enzyme production

温度高于60 ℃时纳豆激酶会失活，试验选取25～50 ℃范围进行研究，由图6可知，NK在35 ℃时酶活最高，温度高于或低于35 ℃酶活均降低，固体发酵过程中反应器内外温差和豆粕基质料层温差对发酵结果的影响很大，在实际生产时，可通入无菌空气和定时翻拌物料来降温，进而增加目标产物[9]。本试验NK的最适发酵温度为35 ℃。

2.2.5 发酵时间对产酶的影响

以干豆粕90 g/250 mL、接种量6%、基质初始含水量55%、pH自然为初始培养条件，35 ℃发酵，每隔3 h取样并保存于4 ℃冰箱中待测，考察发酵时间为3～48 h时的NK酶活，结果见图7。

图7 发酵时间对产酶的影响Fig.7 Effect of fermentation time on enzyme production

由图7可知，发酵初期，NK活性随着时间的增加而迅速增长，发酵18 h后，NK活性趋于稳定，样品镜检发现有芽孢产生，发酵24 h时芽孢最多，36 h后NK产量缓慢下降，发酵时间24 h为最佳。

2.2.6 初始pH对产酶的影响

以干豆粕90 g/250 mL、接种量6%、基质初始含水量55%、35 ℃发酵24 h，考察发酵浸泡水pH分别为3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0时的NK酶活，结果见图8。

图8 初始pH对产酶的影响Fig.8 Effect of initial pH on enzyme production

由图8可知，不同pH条件下对产酶的影响较小，浸泡水pH为7时，酶产量最高，达到3492 IU/g。pH为6.0和7.0时无统计学差异，pH过高或过低均会导致酶产量降低，自然条件下pH值约为6～7，因此不需要调节浸泡水pH。

2.3 发酵工艺优化响应面试验

枯草芽孢杆菌菌株发酵豆粕产纳豆激酶的最优单因素条件：豆粕装量 90 g/250 mL、初始含水量55%、接种量6%、35 ℃恒温培养24 h、初始pH值为自然状态。在单因素试验基础上，依据Box-Behnken试验设计原理，以接种量(A)、发酵温度(B)、发酵时间(C)这3个因素为自变量，以NK酶活(Y)为响应值，设计三因素三水平的试验。响应面试验设计及结果见表2，方差分析结果见表3。

表2 响应面试验设计与试验结果Table 2 Design and results of response surface test

续 表

表3 BBD方差分析结果Table 3 BBD variance analysis results

利用软件得到的二次多项式回归方程为：

Y=5601.80+289.50A+273.25B+282.75C+126.25AB+53.25AC+16.25BC-721.53A2-855.03B2-639.02C2。

由表3可知，回归方程模型的P<0.01，由此可知该模型二次项显著，失拟项不显著(P=0.4768>0.05)，表明建立的模型中并没有异常数据。

综上所述，该回归方程为芽孢杆菌豆粕固体发酵产纳豆激酶提供了一个合理模型，利用 Design Expert软件绘制等高线和响应面图，见图9。

通过对回归方程进行分析，预测出最佳发酵工艺条件为：接种量6.22%、发酵温度35.90 ℃、发酵时间25.40 h，此条件下得出的NK酶活理论值为5691.67 IU/g。 根据实际情况调整预测值，进行验证试验，NK活力实际值为5421 IU/g，与预测值接近，表明利用响应面优化得到的以豆粕为原料的固体发酵工艺条件合理可靠。

3 结论

利用单因素试验结合响应面分析方法对固体发酵工艺参数进行优化，确定了以豆粕为培养基发酵产纳豆激酶的工艺：90 g新鲜的食品级豆粕分装于250 mL锥形瓶中，经过115 ℃灭菌25 min，以6%的接种量将液态种子液接入培养基，加入无菌蒸馏水使总含水量达到55%，在36 ℃可控温控湿培养箱中发酵25 h，发酵物以5倍无菌生理盐水在4 ℃摇床浸提4 h，4500 r/min离心20 min，取上清液测定酶活，枯草芽孢杆菌SWS01固体发酵产纳豆激酶酶活达到5421 IU/g。

鉴于纳豆激酶具有公认的众多保健作用[10-12]，且最新研究发现纳豆有对抗细菌及新冠病毒的效果[13-14]。纳豆的主要活性成分为纳豆激酶，因此利用较低廉的豆粕为原料，生产具有较高附加值的纳豆激酶，在开发保健食品及调味品方面有广阔的应用前景。