马婧嘉 张文隽 李雅茹 吴亚召 雷 萍

（陕西省微生物研究所，陕西西安 710043）

桑黄Sanghuangporusspp.是一类大型珍稀药用真菌，早在《药性论》《新修本草》和《本草纲目》等书中就有对其药性的记载，民间主要用于治疗腮腺炎、淋巴结发炎肿大以及妇女产后血凝，腹内结块等[1-2]。桑黄含多糖类、三萜类、黄酮类、多酚类、甾类等多种活性成分[3-4]，其中多酚是由一个或多个芳香环和多个羟基组成的化合物，具有抗肿瘤、抗氧化能力，是桑黄的主要活性成分之一[5]。超声波辅助提取方法是利用超声波产生的物理综合效应，破坏细胞壁，加速细胞内的成分溶解，提高提取物得率，缩短提取时间[6]。以往文献中桑黄多酚的提取常参考其他植物提取方式，例如桦褐孔菌、三叶青等[7-8]。以桑黄为研究对象的多酚提取文献相对较少。研究以桑黄子实体为原料，采用超声波辅助提取，利用响应面法探索超声波辅助提取桑黄多酚的最佳工艺条件，旨在为桑黄的进一步开发应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验仪器

TU-1901 双光束紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；JP-120ST 超声波清洗仪，深圳市结盟设备有限公司；TD5 离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司。

1.2 试验材料

供试桑黄菌株桑黄-H（Sanghuangporus baumi）为陕西省微生物研究所微生物技术研究中心第二研究室保藏菌种。没食子酸标准品，河南标准物质研发中心；福林酚试剂，Biotopped Life Siciences；水为纯化水；其余试剂为分析纯。

1.3 桑黄总酚的提取

1.3.1 供试品溶液的制备[9]

准确称取桑黄子实体粉末1.0 g，置于50 mL 具塞三角瓶中，加入一定体积的乙醇，在规定温度下超声提取一定时间，冷却至室温，4 000 r/min 离心10 min，收集滤渣加入一定体积的乙醇，在规定温度下超声提取一定时间，冷却至室温，4 000 r/min 离心10 min，合并两次上清液定容至100 mL 量瓶中，作为供试品溶液。

1.3.2 标准曲线的制备

称取10 mg 没食子酸对照品，加60%乙醇定容至100 mL，即得100µg/mL 的没食子酸标准品溶液，分别移取 0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL 置于10 mL 容量瓶中，以蒸馏水作为空白对照，分别加入福林酚试剂0.5 mL，振荡1 min摇匀，加10%碳酸钠2 mL，摇匀后蒸馏水定容，室温避光放置2 h，于750 nm 处测定其吸光度，并绘制标准曲线，计算得线性回归方程：Y没食子酸=0.7489X-0.0079（R2=0.999），没食子酸与吸光度的线性关系良好。

1.4 单因素试验

1.4.1 乙醇体积分数对桑黄总酚提取效果的影响

固定料（g）液（mL）比1∶25，超声提取温度50 ℃，提取时间30 min，乙醇体积分数分别为40%、50%、60%、70%和80%，考察不同体积分数的乙醇对桑黄总酚得率的影响，筛选适合的乙醇体积分数。

1.4.2 料液比对桑黄总酚提取效果的影响

固定乙醇体积分数为70%，提取时间30 min，提取温度50 ℃，按照料（g）液（mL）比1∶15、1∶25、1∶30、1∶35、1∶45 加入提取溶剂，考察不同料液比对桑黄总酚得率的影响。

1.4.3 提取时间对桑黄总酚提取效果的影响

固定料（g）液（mL）比1∶25，提取温度50 ℃，乙醇体积分数70%，分别超声提取20 min、30 min、40 min、50 min、60 min，考察提取时间对桑黄总酚得率的影响。

1.4.4 提取温度对桑黄总酚提取效果的影响

固定料液比1∶25，乙醇体积分数70%，提取时间 30 min，提取温度分别为 20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃，考察提取温度对桑黄总酚得率的影响。

1.5 响应面分析的设计与拟合模型

以单因素试验结果为基础，选取乙醇体积分数、提取时间和提取温度3个因素为自变量，以桑黄总酚得率为响应值，采用Box-Benhnken 中心组合试验设计3 因素3 水平的响应面分析法对桑黄总酚提取过程进行优化，以达到最大限度提取桑黄总酚的目的。试验因素与水平设计见表1。

表1 Box-Benhnken试验设计各因素水平

1.6 桑黄总酚提取方法对比

响应面拟合最佳提取条件与《安徽省中药饮片炮制规范》[10]中的多酚提取法进行对比。

1.7 桑黄总酚的得率计算

桑黄总酚得率（质量比）＝c×100×10/m（式中：100 为样品体积；10 为稀释倍数；c为总酚含量，m为称取样品质量g）。

1.8 数据处理

用Design expert 8.0.6.1 软件处理数据，运用GraphPad Prism 7.00作图。

2 结果与分析

2.1 提取溶剂乙醇体积分数试验结果

由图1所知，随着乙醇体积分数的增加，桑黄总酚得率逐渐上升，当乙醇体积分数为70%时，桑黄总酚得率最高，当乙醇体积分数为80%时，桑黄总酚得率下降，这可能与桑黄中酚类化合物都具有羟基有关，与70%乙醇极性相似，所以溶解度最大[11]。差异显著性分析（P＜0.05）结果，乙醇体积分数50%与60%差异不显著，与70%差异显著，因此选择体积分数70%的乙醇作为提取溶剂。

图1 乙醇体积分数对桑黄总酚得率的影响

2.2 料液比试验结果

由图2 可知，料液比对桑黄总酚得率的影响并不显著，当料液比＞1∶25 后，桑黄总酚得率基本保持不变，且P＜0.05显著性分析表明，料液比为1∶25时，桑黄总酚得率与料液比1∶30、1∶35、1∶45 差异不显著。考虑到料液比上升会增加溶剂使用量[12]，故选择料液比为1∶25。

图2 料液比对桑黄总酚得率的影响

2.3 提取时间试验结果

由图3可知，随着提取时间的延长，桑黄总酚得率逐渐上升，提取时间50 min 时桑黄总酚得率达最高。再延长提取时间，桑黄总酚得率下降，可能是由于随着提取时间的增加，其他成分增多后会干扰多酚类物质的溶出[13]。显著性分析结果表明（P＜0.05），提取时间50 min 与其他处理差异显著，因此选择提取时间50 min左右为宜。

图3 提取时间对桑黄总酚得率的影响

2.4 提取温度试验结果

由图4 所知，提取温度在20~80 ℃，随着提取温度的上升，桑黄总酚得率不断地提高，提取温度为80 ℃时桑黄总酚得率达最高，再提高提取温度，桑黄总酚得率下降。由显著性分析结果（P＜0.05）也可看出，提取温度80 ℃与其他处理差异显著。提取温度过高溶剂可能损失较多，影响提取效果，因此选择提取温度在80 ℃左右为宜。

图4 提取温度对桑黄总酚得率的影响

2.5 桑黄总酚的提取工艺响应面法优化结果

由于料液比达一定程度后，其对提取桑黄总酚得率影响不大，因此响应面优化时采用Box-Benhnken中心组合试验设计3 因素3 水平的响应面分析法，对桑黄总酚提取进行优化，响应面分析方案及试验结果见表2。由Design expert 8.0.6.1软件处理数据，其方差分析结果见表3。对响应值与各个因素进行回归拟合，该模型对应的回归方程如下Y=- 1 149.56+4.58A+26.55B+4.78C-0.04AB+0.002AC+0.04BC-0.02A2-0.17B2-0.06C2

表2 响应面分析方案及结果

表3 回归方程方差分析

对二次回归方程进行方差分析，模型P＜0.01，此时回归方差模型极显著，该试验方法可靠。方程失拟项不显著，表明该回归模型与实测值能较好地拟合。回归系数R2=0.9829＞0.9，表明该模型相关度好。回归方程各项的方差分析表明：B、C、B2、C2均达极显著水平（P＜0.01），AB、BC达显著水平（P＜0.05）。同时由F值可推断，在所选择的试验范围内，3 个因素对桑黄多酚得率的影响大小依次为提取温度（B）＞乙醇体积分数（C）＞提取时间（A）。

响应面Y对应因素A、B、C值构成的三维空间在二维平面上的等高图可直观地反映各因素之间的相互作用。Design expert 8.0.6.1 软件处理得到响应面分析结果见图5—图7。可以看出，3 个三维图均有最高点，表明试验所选提取时间、提取温度和乙醇体积分数3 个因素的设定值范围内包含响应极值；二次项中提取时间与提取温度、乙醇体积分数和提取时间的曲面效应显著，表现为等高线的形状为椭圆形，说明桑黄总酚的提取过程各因素之间能够相互影响，且不是简单的线性关系。乙醇体积分数与提取温度成圆形，表明它们之间交互作用较弱。

图5 提取时间、提取温度对提取效果交互作用

图6 乙醇体积分数、提取时间对提取效果交互作用

图7 乙醇体积分数、提取温度对提取效果交互作用

根据所得到的模型，预测最优工艺条件：乙醇体积分数65.9%、提取时间48.2 min、提取温度77.9 ℃，在此条件下桑黄总酚的得率理论上可达152.95 mg/g。为了便于控制试验条件，调整方案为乙醇体积分数65%、料液比1∶25、提取温度78 ℃、提取时间48 min。在此条件下重复试验3 次，并计算桑黄总酚得率，其平均值为152.78 mg/g，实际值与预测值较为接近，充分验证所建模型的正确性，说明响应面分析方法适用于桑黄总酚的超声提取工艺的优化。

2.6 桑黄中总酚的提取工艺对比

采用响应面法优化工艺条件乙醇体积分数65%、料液比1∶25、提取温度78 ℃、提取时间48 min与安徽中药饮片炮制规范中桑黄多酚甲醇提取法料（g）液（mL）比 1∶500、超声功率 150 W、频率40 kHz、提取时间30 min 进行对比试验。结果表明响应面优化工艺桑黄总酚得率为152.78 mg/g，甲醇提取桑黄总酚得率为91.84 mg/g，响应面优化工艺条件桑黄总酚得率提升66.4%，差异显著（P＜0.05）（图8）。

图8 桑黄总酚的不同方法提取效果比较

3 小结

植物多酚广泛存在于自然界中，桑黄中的多酚是其主要的活性成分之一，具有抗氧化等作用。超声波能瞬时产生高压的空化作用，使细胞中的有效成分更容易被溶剂溶出，从而提高提取效率[14]。响应面法是通过回归模型方程以及响应面图的建立与分析，表示出响应值与各个因素之间的函数关系以及各个因素间的交互作用，从而高效地优化出最佳响应值多因素的组合条件，因此被广泛应用于各种工艺条件优化中[15]。研究通过单因素试验和响应面试验基本确定提取桑黄总酚的最佳工艺条件为：料（g）液（mL）比1∶25，乙醇体积分数 65%，提取温度78 ℃、提取时间48 min，在此条件下桑黄总酚得率为152.78 mg/g。经验证，在该工艺条件下桑黄总酚得率稳定。除了料液比其他3个提取条件对桑黄总酚得率的影响依次为提取温度＞乙醇体积分数＞提取时间，3 个提取条件交互作用对桑黄总酚得率的影响依次为：提取时间、提取温度＞乙醇体积分数、提取时间＞乙醇体积分数、提取温度。响应面优化桑黄总酚提取工艺，减少溶剂用量，使后续提取工艺得到简化，同时显著提高桑黄总酚提取率，是一种较为高效的提取方法。